miR-4311模拟物在制备肺癌治疗药物中的应用的制作方法

mir-4311模拟物在制备肺癌治疗药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及mir-4311模拟物在制备肺癌治疗药物中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居于所有癌症导致死亡的前列。近年来，肺癌的发病率在全球范围内不断上升，严重威胁着人类的健康。肺癌细胞增殖并转移至淋巴结、胸膜、肾脏、消化道等部位会加重疾病，影响患者生命安全，因此，探究影响肺癌细胞增殖、转移因素对明确肺癌发生发展机制至关重要。
4.微小rna（microrna，mirna）是一种广泛表达于植物和动物体内的短链、非编码的基因调控因子。自发现mir-lin4至今，人类基因组中发现的mirna基因已达2500个以上，在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程的调节中发挥重要作用。已有的研究表明mirna参与了多种细胞生命活动，尤其是在癌症中。但不同的mirna在癌症中发挥的作用不同，有的mirna可作为致癌基因，有的mirna则作为抑癌基因。鉴于mirna在癌症发生发展的重要作用，开发新的基于mirna的肺癌治疗药物将具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供mir-4311模拟物在制备肺癌治疗药物中的应用。本发明从极其多的mirna中深入探索具有癌症治疗效果的mirna，结果发现过表达mir-4311能够抑制非小细胞肺癌细胞a549转移，具有促进a549细胞凋亡的作用，因此，mir-4311可以开发成为抑制肺癌的药物，由此提出了本发明。
6.本发明是通过如下技术方案实现的：本发明的第一方面，提供增强mir-4311基因表达的物质在制备治疗肺癌的药物中的应用；所述mir-4311基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：tcagagaggggaaagagagctgagtgtgacctggagcagctcaggagggcttcctgggtgaggtggcaggttacaggttcgatctttggccctcagattc；（seq id no.1）上述应用中，增强mir-4311基因表达的物质可以为包含有mir-4311基因的表达载体；也可以为能够激活或提高mir-4311基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性的dna片段。
7.本发明的第二方面，提供增加mir-4311含量的物质在制备治疗肺癌的药物中的应用；所述mir-4311的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：gaaagagagcugagugug；（seq id no.2）本发明的第三方面，提供mir-4311模拟物（mir-4311 mimics）在制备治疗肺癌的药物中的应用。
8.上述应用中，所述mir-4311模拟物为模拟mir-4311活性的mirna。
9.优选的，所述mir-4311模拟物由正义链和反义链组成，所述正义链的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述反义链的核苷酸序列如seq id no.4所示。具体如下：s:gaaagagagcugagugug；（seq id no.3）as:cacucagcucucuuucuu。（seq id no.4）本发明的第四方面，提供上述增强mir-4311基因表达的物质在制备抑制肺癌细胞迁移和/或促进肺癌细胞凋亡的药物中的应用。
10.本发明的第五方面，提供上述增加mir-4311含量的物质在制备抑制肺癌细胞迁移和/或促进肺癌细胞凋亡的药物中的应用。
11.本发明的第六方面，提供mir-4311模拟物在制备抑制肺癌细胞迁移和/或促进肺癌细胞凋亡的药物中的应用；所述mir-4311模拟物由正义链和反义链组成，所述正义链的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述反义链的核苷酸序列如seq id no.4所示。
12.本发明的第七方面，提供一种治疗肺癌的药物，所述药物中包含：mir-4311模拟物和核酸转染剂；所述mir-4311模拟物由正义链和反义链组成，所述正义链的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述反义链的核苷酸序列如seq id no.4所示。
13.所述核酸转染剂可以为脂质系转染剂、聚合物系转染剂、磁性粒子系转染剂、核酸递送用外泌体或核酸递送用病毒蛋白质等。
14.本发明的有益效果：本发明首先发现mir-4311在制备肺癌治疗药物中的用途，并进一步构建了mir-4311模拟物，通过试验发现：该模拟物能够抑制肺癌细胞转移，具有促进肺癌细胞凋亡的作用。本发明对于开发新的肺癌治疗药物将具有十分重要的意义。
附图说明
15.图1：mir-4311在非小细胞肺癌患者（患者）及健康对照（正常）的血清中的表达水平量化统计。通过对非小细胞肺癌患者及健康对照血清mir-4311表达情况进行分析可知，非小细胞肺癌患者血清中mir-4311相对表达量为（4.35
±
0.75），而健康对照则为（27.45
±
0.86），***p《 0.001，n=8。
16.图2：非小细胞肺癌患者中肺癌组织及其癌旁组织中mir-4311表达水平量化统计。通过对非小细胞肺癌患者肺癌组织及其癌旁组织mir-4311表达情况进行分析可知，肺癌组织中mir-4311相对表达量为（2.62
±
0.45），而癌旁组织则为（13.27
±
0.54），***p《 0.001，n=8。
17.图3：mir-4311在非小细胞肺癌细胞a549中成功过表达。a549细胞转染mir-4311模拟物，24h后收集细胞总rna，逆转录后实时荧光定量pcr检测mir-4311表达。****p《 0.0001，n=3。
18.图4：mir-4311模拟物能够引起非小细胞肺癌细胞a549凋亡。 a．分别用microrna 阴性对照或mir-4311模拟物处理a549 12/24h，10
×
显微镜观察分析a549细胞存活情况；b. hoechst 33258检测mir-4311模拟物处理引起的a549凋亡情况，20
×
倒置荧光显微镜拍照
分析；c. hoechst 33258检测各处理组诱导细胞凋亡量化图。****p《0.0001，n=3。
19.图5：mir-4311模拟物抑制非小细胞肺癌细胞a549的迁移。a. 分别用microrna 阴性对照或mir-4311模拟物处理a549 6h/12h，10
×
显微镜观察分析细胞迁移情况。b. 各处理组诱导细胞迁移量化统计。****p《 0.0001，n=3。
具体实施方式
20.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
21.如前所述，mirna的数量众多，且不同的mirna在癌症中发挥的作用不同。目前还未见有mir-4311在肺癌治疗中的相关报道。
22.本发明通过研究发现mir-4311是在非小细胞肺癌细胞a549中下调最明显的microrna之一。进一步地，本发明构建了mir-4311模拟物转染非小细胞肺癌细胞a549，结果表明与阴性对照组相比，mir-4311模拟物转染组细胞迁移能力减弱，凋亡数量明显增加。因此，可以认为，mir-4311能够抑制肺癌细胞的转移，具有引起肺癌细胞凋亡的能力，能够抑制肺癌的发生和发展。因此，mir-4311模拟物可以用于制备抑制肺癌的药物。
23.所述mir-4311基因的核苷酸序列为：tcagagaggggaaagagagctgagtgtgacctggagcagctcaggagggcttcctgggtgaggtggcaggttacaggttcgatctttggccctcagattc；（seq id no.1）所述mir-4311的核苷酸序列为：gaaagagagcugagugug；（seq id no.2）所述mir-4311模拟物的序列为：s:gaaagagagcugagugug；（seq id no.3）as:cacucagcucucuuucuu。（seq id no.4）为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
24.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
25.实施例1：血清microrna分析1.血清microrna的提取（1）吸取400μl冻存的非小细胞肺癌患者血清，加入750μl裂解液mrl，吹打几次。
26.（2）将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的rnase free的离心管中。
27.（3）每750μl裂解液加200μl氯仿，剧烈震荡15s并将其在室温下孵育3min。
28.（4）于4℃ 12000rpm离心10min，样品会分成3层，去上层水相，移到新的rnase free ep管中。
29.（5）加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱ra中。
30.（6）10000rpm离心45s，收集下滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液倒入吸附柱rb，10000rpm离心30s，弃掉废液。
31.（7）加入700μl漂洗液rw，12000rpm离心60s，弃掉废液。
32.（8）加入500μlrw，12000rpm离心60s，弃掉废液。
33.（9）将吸附柱rb放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
34.（10）取出rb，放入到一个新的rnase free ep管中，在吸附膜中间加30μl 无核酸酶水，室温放置2min，12000rpm离心1min。收集得到纯净microrna保存于-80℃。
35.2.microrna逆转录（1）取2μg细胞或组织总rna，在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。按照表1配制混合液。
36.表1： microrna逆转录体系组分名称用量（μl）mirna反转录酶混合物1.25μl2
×
mirna反转录反应液5μl总rna2μg-20ngdepc水补足至10μl（2）37℃ 60min，85℃，5min后放于冰上，得到的microrna cdna可用于后续实验，或置于-20℃保存。
37.3.real-timepcr检测microrna表达（1）以上述逆转录反应得到的cdna为模板，每个待测基因每个模板设置三个复孔，在冰上操作，反应体系配制如表2。
38.表2： 实时荧光 pcr反应体系表2中，mirna-特定引物（mir-4311 5’引物）：gaaagagagctgagtgtgaaa（5'
→
3'）；(seq id no.5)mirna qpcr 3’通用引物包含在accurate biotechnology（hunan）co.,ltd的mirna cdna第一链合成试剂盒中。
39.（2）按照两步法pcr设定反应步骤。
40.（3）反应结束，根据熔解曲线和ct值，按照2-δδct
计算得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。
41.在临床诊断中，血清检测作为无创诊断具有很大的优势，microrna等小分子在外周血血清中的表达往往与肺癌的发展密切相关。通过实时荧光定量pcr分别检测正常人，肺癌患者血清中mir-4311表达水平，应用2
‑△△
ct
公式计算得到mir-4311的相对表达量。应用
graphpad prism软件分析，对不同分组mir-4311的表达进行u检验。
42.结果表明：与正常人血清相比，mir-4311在肺癌患者血清中的表达下调（图1）。
43.实施例2：组织microrna分析（1）手术切除肿瘤组织及距离肿瘤组织3.5cm以上的癌旁组织，将采集到的组织置于-80℃保存。
44.（2）实验时将肿瘤组织取出，加入trizol溶液500μl于4℃裂解30min，1000g 离心10min。
45.（3）随后取上清液用苯酚－氯仿－异戊醇抽提，无水乙醇沉淀。待残留乙醇完全挥发后加入50μl去离子水溶解rna。
46.（4）用逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna，使用实时荧光定量pcr试剂盒对mir-4311的表达量进行检测，配套使用荧光定量pcr仪进行检测。
47.通过实时荧光定量pcr分别检测肺癌患者的肺癌组织及其癌旁组织中mir-4311表达水平，应用2
‑△△
ct
公式计算得到mir-4311的相对表达量。
48.结果表明：与癌旁组织相比，肺癌组织中mir-4311表达明显降低（图2）。
49.实施例3：mir-4311在肺癌细胞凋亡中的应用研究1. 设计mir-4311模拟物：为获得mir-4311的高效表达，设计合成了mir-4311模拟物。其中，mir-4311模拟物以及阴性对照序列如下：mir-4311模拟物：s:gaaagagagcugagugug；（seq id no.3）as:cacucagcucucuuucuu。（seq id no.4）microrna阴性对照：s:uucuccgaaggugucacgutt；（seq id no.6）as:acgugacacguucggagaatt。（seq id no.7）2.转染效率测定：（1）转染前一天，胰酶消化预转染的a549细胞，调整细胞浓度为2x105个/皿接种于60mm培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱培养。
50.（2）16-24h后，细胞密度达到80％，将皿内完全培养基（90%rpmi-1640培养基+10%fbs，体积分数）换成rpmi-1640培养基。
51.（3）取5μl的mir-4311模拟物或microrna阴性对照稀释于500μl rpmi-1640培养基中。
52.（4）取7.5μl lipofectamine2000脂质体稀释于500μl rpmi-1640培养基中。
53.（5）将稀释好的脂质体与mircorna（即：mir-4311模拟物或microrna阴性对照）混合，室温孵育20min，得到mircorna脂质体混合液。
54.（6）将mircorna脂质体混合液加入到培养皿中，轻轻摇动混匀。
55.（7）37℃，5％co2培养箱中培养6-8h后，更换为完全培养基继续培养24h，收集总rna，microrna检测试剂盒检测mir-4311的表达。
56.结果表明：转染mir-4311模拟物组中的mir-4311表达效率较高，在非小细胞肺癌a549细胞中上调30倍以上（图3），因此采用该mir-4311模拟物进行后续的过表达实验。
57.3.细胞转染：（1）转染前一天，胰酶消化预转染的a549细胞，调整细胞浓度为2x105个/皿接种于60mm培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱培养。
58.（2）16-24h后，细胞密度达到80％，将皿内完全培养基（90%rpmi-1640培养基+10%fbs，体积分数）换成rpmi-1640培养基。
59.（3）取5μl的mir-4311模拟物或microrna阴性对照稀释于500μl rpmi-1640培养基中。
60.（4）取7.5μl lipofectamine2000脂质体稀释于500μl rpmi-1640培养基中。
61.（5）将稀释好的脂质体与mircorna（即：mir-4311模拟物或microrna阴性对照）混合，室温孵育20min，得到mircorna脂质体混合液。
62.（6）将mircorna脂质体混合液加入到培养皿中，轻轻摇动混匀。
63.（7）37℃，5％co2培养箱中培养6-8h后，更换为完全培养基继续培养。分别在12h/24h时显微镜观察拍照。
64.4. hoechst 33258 活细胞染色：取部分细胞在转染12h进行hoechst33258染色，检测凋亡细胞。
65.（1）配染液：0.1mg/ml hoechst33258储液用完全培养液稀释100倍，hoechst33258染液终浓度为10μg/ml；（2）吸出细胞转染后的完全培养基，用 1
×
pbs 洗两遍，加入2ml/皿hoechst33258（10μg/ml）染液；（3）37℃孵育 15 min；（4）吸出染液，用 1
×
pbs 洗两遍，再加入 500μl/皿pbs；（5）倒置荧光显微镜下观察并拍照。
66.本发明发现mir-4311模拟物能够引起肺癌细胞的凋亡。a549贴壁生长24h至密度80%左右，分别使用lipofectamine2000脂质体转染mir-4311模拟物和阴性对照，转染6-8h后换成完全培养基，分别在12h/24h时显微镜观察拍照；a549贴壁生长24h至密度80%左右，分别转染mir-4311模拟物和表达载体，转染6-8h后换液，转染12h进行hoechst33258染色，检测凋亡细胞。
67.结果表明：与阴性对照组相比，mir-4311模拟物转染组细胞数量呈时间依赖性降低（图4中a）；与阴性对照组相比，mir-4311模拟物转染组细胞凋亡数量明显增加（图4中b、c），表明过表达mir-4311能够促进a549细胞凋亡，抑制肺癌发展。
68.实施例4：mir-4311在抑制肺癌细胞迁移中的应用研究a549细胞按 2
×
105个/皿接种于60mm培养皿中，a549细胞贴壁生长24h至密度80%左右，分别使用lipofectamine2000脂质体转染mir-4311模拟物和microrna阴性对照，转染方法同实施例3，转染6-8h后换成完全培养基（90%rpmi-1640培养基+10%fbs，体积分数），用200μl枪尖于皿底均匀划线并拍照。6-12h后，再次拍照观察细胞迁移程度。
69.迁移率=[（0h划痕宽度-培养后划痕宽度）/0h划痕宽度]
×
100%。
[0070]
结果表明：与阴性对照组相比，mir-4311模拟物转染组细胞迁移能力明显减弱，表明mir-4311模拟物能够在体外抑制肺腺癌细胞a549的迁移（图5）。
[0071]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技
术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。