miR-218-5p化合物作为慢性疼痛标志物和在治疗炎症性慢性疼痛药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，尤其是涉及miR-218-5p化合物的用途，包括：(1)筛选miR-218-5p靶标基因并通过报告基因进行验证，利用完全弗氏佐剂(CFA)制作炎性慢疼痛模型小鼠；(2)利用miR-218-5p模拟物增加该miRNA在炎症慢性疼痛小鼠脊髓表达量；(3)利用Western?blot法检测miR-218-5p对CFA致炎症慢性疼痛的SYNGR1蛋白表达的抑制作用；(4)检测miR-218-5p抑制炎症慢疼痛状态的脊髓神经元活动标记物c-fos的表达。本发明工艺简单成本低，采用miR-218-5p有效的抑制了炎性慢性疼痛，为慢性疼痛的防治提供有效干预靶点。具体是miR-218-5p化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。进一步对慢性疼痛病人的血液临床标本进行了定量分析，表明miR-218-5p能作为慢性疼痛发生的标志物。
【专利说明】miR-218-5p化合物作为慢性疼痛标志物和在治疗炎症性慢性疼痛药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微小RNA分子的用途，尤其是涉及miRNA在炎性慢性疼痛中的用途，具体是一种miR-218-5p化合物作为慢性疼痛标志物和在治疗慢性疼痛药物中的应用，属于生物医学材料【技术领域】。
【背景技术】
[0002]疼痛是临床上最常见的症状之一，长期存在的病理性疼痛伴发着心理和情绪疾病给慢性疼痛患者在生活上带来了难以忍受的折磨。据统计，全球慢性疼痛的患者高达3.2亿，全世界各国政府投入了大量的人力及每年上千亿美元的财力试图去攻克这一难题，仅在中国就存在数以亿计的疼痛患者，这无疑是人类目前迫不及待需要解决的难题。
[0003]神经细胞中含miRNA较其他组织细胞多，miRNA在突触部位的选择性聚集或缺失，可以调节突触局部的基因表达和蛋白合成，影响神经细胞突触功能。神经系统疾病，比如帕金森、精神分裂症、老年痴呆、亨廷顿病、神经母细胞瘤等都与miRNA表达和功能异常相关。
[0004]尽管miRNA与慢性疼痛关系的研究尚处起步阶段，但已有少量基础研究提不miRNA可能参与痛觉调制。miRNA为新药的开发提供了一个全新思路，很可能是一个有效的药物标靶。Bai等人通过对大鼠咀嚼肌内注射完全弗氏佐剂(CFA)造成炎症性肌肉疼痛动物模型，并利用荧光实时定量PCR(qPCR)与原位杂交技术对不同时间点三叉神经节内神经元特异的 miRNA 的表达分析发现，患侧 miR-10a、miR_29a、miR-98、miR_99a、miR_124a、miR-134及miR-183等较健 侧均有不同程度的表达水平下调，这表明炎症性疼痛与神经元特异的miRNA表达水平之间存在着一定联系。随后,Favereaux等研究了 miR-103介导慢性疼痛的发生过程，发现CFA疼痛小鼠脊髓背角miR-103表达明显降低，当脊髓背角miR-103过表达时，钙离子通道 Cavl.2-LTC(Cav1.2-comprising L-type calcium channel)的表达则明显降低，小鼠痛阈显著升高。
[0005]关于miR-218_5p作为一种慢性疼痛疾病临床诊断标志物和在制备治疗慢性疼痛药物中的应用目前尚未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种miR-218_5p化合物作为慢性疼痛疾病临床诊断的标志物及其应用。采用化学合成的miR-218-5p有效的降低炎性慢性疼痛阈值，并抑制神经元活动标志蛋白c-fos的表达，从而进一步明确了炎性慢性疼痛的发病机制，为防治提供有效的干预靶点。
[0007]本发明的另一目的在于提供miR-218_5p化合物作为制备治疗慢性疼痛药物的应用。
[0008]本发明的一种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，包括:
[0009](I)筛选miR-218_5p靶标基因，并进行验证，利用完全弗氏佐剂对小鼠足底进行注射，制作炎性慢疼痛模型小鼠；
[0010](2)利用miR-218-5p模拟物增加该miRNA在小鼠脊髓的表达量；
[0011](3)利用Western blot法检测miR-218_5p模拟物对CFA诱导的SYNGRl蛋白表达的抑制作用；
[0012](4)检测miR-218_5p抑制炎症慢疼痛状态的脊髓神经元活动标记物c-fos的表达。
[0013]所述步骤⑴中的CFA注射量为40微升。
[0014]所述步骤(2)中的miR-218-5p模拟物为包含miR-218_5p核酸序列“茎一环”结构的发夹状结构，其主序列如下附表1 (I)。
[0015]作为疼痛抑制基因，miR-218_5p能显著抑制慢性疼痛的发生。对慢性疼痛病人的血样标本进行定量分析发现，miR-218-5p在病人血样中的表达也是明显下调。研究结果表明通过检测或干涉神经中枢中miR-218-5p的表达可为慢性疼痛的诊断或治疗提供新的方案。
[0016]有益效果:
[0017]本发明工艺简单，成本低，采用化学合成的miR-218_5p有效的降低了炎症慢性疼痛热激阈值，从而进一步明确了炎性慢性疼痛的发病机制，为防治提供有效的干预靶点及药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为CFA状态下小鼠脊髓miR-218_5p差异表达；
[0019]图2为鞘内注射miR-218_5p模拟物降低CFA小鼠疼痛阈值；
[0020]图3为计算机软件分析显示SYNGRl的3’非翻译区存在一个miR-218_5p的作用靶点；
[0021]图4为miR-218-5p能够抑制携带SYNGRl靶序列萤光素酶的相对活性；
[0022]图5为miR-218_5p能够抑制神经可塑性相关基因SYNGRl蛋白水平的表达；
[0023]图6为miR-218_5p能够有效减少炎症状态脊髓神经元标志物c_fos的表达。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0025]1、CFA慢性关节炎疼痛模型制备及脊髓水平miR-218_5p表达:
[0026]SPF级雄性6周昆明雄性小鼠在异氟醚麻醉下，围绕左后足足跖关节部选择两点皮内注射无菌完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA ;Sigma公司)40 μ 1，该注射浓度可诱导产生关节炎。在注射后的24小时即出现热和机械痛觉阈值的降低并可维持3周以上。
[0027]MiR-218-5p的表达分析:运用miRNA检测试剂盒对miR-218_5p进行荧光定量分析，结果显示，CFA三天小鼠脊髓表达量发生显著下调表达(附图1)。[0028]2、采用miR-218_5p模拟物在体过量表达脊髓miRNA。
[0029]采用合成miR-218-5p的RNA序列。先将miR-218_5p用脂质体包裹:脂质体与5%葡萄糖液按2:3比例混匀后，迅速加入等体积的miR-218-5p (25 μ Μ)溶液，充分混匀，室温下静置10分钟后应用，即为脂质体miR-218-5p混合物。再将混合物进行鞘内注射:每只小鼠每天麻醉后，注射2次miR-218-5p (25 μ Μ)，每次10 μ 1，每次时间12小时，注射后注射器停留组织内60s，共2天，最后一次注射2h后开始检测。
[0030]疼痛行为监测:热痛觉过敏:将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上,按Hargreaves法用热辐射刺激以照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至大鼠出现抬足时间，截止时间为20s。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定时间间隔5min。结果表明，鞘内注射miR-218-5p模拟物后可显著降低疼痛阈值(附图2)。
[0031]3、miR-218_5p靶基因的筛选方法
[0032]运用Ta rgetScan, PicTar等软件检索miR-218_5p可能的祀基因，发现SYNGRl基因的3’非翻译区(3’UTR)含有I个miR-218-5p的靶位点(附图3)，靶位点序列见附表I (2)。选定神经可塑性相关基因SYNGRl作为候选被调控基因。
[0033]4、报告基因验证SYNGRl是miR-218_5p的靶基因
[0034]构建psiCHECK2-SYNGRl-3’ UTR重组质粒，与miR-218_5p模拟物共转染工具细胞293T，转染24h后冻融细胞一次，用专用裂解液裂解细胞，每孔10ul，吹打均匀，充分裂解后样品备用。采用Promega公司的萤光素酶检测试剂盒,在1.5ml离心管中加入LAR工工50ul和裂解液5ul混匀，酶标仪检测萤火虫萤光素酶；加入50ulStop&Glo溶液灭活萤火虫萤光素酶，酶标仪检测海肾萤光素酶。结果显示，转染scRNA对萤光素的表达无影响。而转染miR-218-5p模拟物后萤光素的表达分别下降了约40%左右(见附图4)。
[0035]5、利用Western blot法检测miR-218_5p模拟物对CFA诱导的SYNGRl蛋白表达的抑制作用
[0036]制备CFA炎性慢疼痛小鼠，鞘内注射miR-218_5p模拟物，2天后取小鼠脊髓腰膨大区蛋白样品进行电泳。电泳时，按每孔20ug蛋白上样量等量上样。以150V电泳1.5h，100V电压下转膜lh。将膜放入自封袋中，加入5 %脱脂奶粉/TBST，完全浸泡膜并封口，于室温下振荡封闭lh。加入TBST稀释后SYNGRl或对照GAPDH抗体一抗(抗血管紧张素I型受体抗体按1:1000稀释，抗GAPDH抗体按1:1000稀释)，4°C振荡孵育过夜。吸净一抗，TBST漂洗膜5min X3 ;加入稀释后的二抗(均为1:5000稀释)，水平摇床室温孵育lh。吸净二抗，TBST漂洗膜，5min X3，等体积混合ECL (AB液)，充分覆盖湿润NC膜表面，静置Imin ;于暗室中用保鲜膜将NC膜封好，将X光片平放于NC膜上显影并记录数据。结果可见，在CFA的刺激下，脊髓腰膨大区SYNGRl蛋白的表达量明显升高。然而鞘内增加了 miR-218-5p模拟物的表达量后，CFA诱导的SYNGRl蛋白的表达量明显下降。(见附图5)
[0037]6、免疫组化检测鞘内注射miR-218_5p模拟物c_fos表达
[0038]石蜡切片置于67°C烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟(3X3’)。取一定量pH = 6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2X3’。每张切片加I滴3% H202，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3X3’。去除去PBS液，每张切片加I滴相应的第一抗体(c-fos抗体)，室温下孵育2小时。PBS冲洗3X5’。除去PBS液，每张切片加I滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3 X 3’。除去PBS液，每张切片加I滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3X5’。除去PBS液，每张切片加I滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺)，显微镜下观察5分钟。苏木素复染，0.1% HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。鞘内增加了 miR-218-5p模拟物的表达量后，CFA诱导 的c-fos蛋白的表达量明显下降。(见附图6)
【权利要求】
1.一种miR-218-5p化合物作为慢性疼痛疾病标志物。
2.一种应用miRNA制备抑制炎症性慢性疼痛药物，包括: (1)筛选miR-218-5p靶标基因，并进行验证，利用完全弗氏佐剂对小鼠足底进行注射，制作炎性慢疼痛模型小鼠； (2)利用miR-218-5p模拟物增加该miRNA在小鼠脊髓的表达量； (3)利用Westernblot法检测miR-218_5p模拟物对CFA诱导的SYNGRl蛋白表达的抑制作用； (4)检测miR-218-5p抑制炎症慢疼痛状态的脊髓神经元活动标记物c-fos的表达。
3.根据权利要求2所述的一种应用miRNA制备抑制炎症性慢性疼痛药物，其特征在于:所述步骤(1)中的CFA注射量为40微升。
4.根据权利要求2所述的应用miRNA制备抑制炎症性慢性疼痛药物，其特征在于:所述步骤(2)中的miR-218-5p模拟物为包含miR-218_5p核酸序列“茎一环”结构的发夹状结构，其主序列如下:5’ -ACAUGGUUAGAUCAAGCACA-3’。
【文档编号】A61P29/00GK104031999SQ201410251115
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】曹君利, 李燕强, 杨俊霞 申请人:徐州医学院