肺腺癌相关的miRNA、组合物及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及肺腺癌相关的mirna、组合物及其应用，更具体的涉及mir-6087、mir-7976、mir-7705、mir-6744-5p及其组合物在制备肺腺癌诊断制剂中的应用。
背景技术：
：肺癌是死亡率较高的恶性肿瘤之一，主要包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，临床发病中以非小细胞肺癌居多，约占80％，非小细胞肺癌进一步可以细分为腺癌和鳞癌两大类型。近年来随着精准医疗的不断发展，肺癌的个体化治疗要求对肺癌进行分子水平的精准分型，虽然已经有很多报道披露部分肺癌的诊断分子标志物，但是仍不能满足需求，需要更多的分子标志物助力肺癌的分子分型、靶向治疗以及预后判断。mirna是一类长度约22个核苷酸的非编码内源性小rna，具有多种生物学功能，对生长发育、生理功能尤其在恶性肿瘤的发生发展等过程产生重大影响，与mrna相比，mirna在体外更稳定，在体内代谢周期更长，因而更适合作为肿瘤分子标记物。多项研究发现mirna和肺癌的发生发展有密切关系，例如yanaiharan等研究表明肺癌患者有约有66％的人的mir-21表达水平至少有2倍以上的上调，weiss等研究发现mirna-128b缺失的肺癌细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼十分敏感。本发明对4对癌组织及癌旁组织的样本进行转录组测序，并运用生物信息学方法进行分析，发现了几个之前从未被报道过的与肺腺癌相关的分子标志物，其中，mir-6087、mir-7976在癌组织中表达低于癌旁组织，mir-7705、mir-6744-5p在癌组织中的表达量高于癌旁组织，进一步，荧光定量pcr实验结果验证了高通量测序的分析，表明mir-6087、mir-7976、mir-7705、mir-6744-5p很有可能成为新的肺腺癌诊断标志物，本发明为临床肺腺癌的精准诊断提供了潜在的分子标志物，具有重要的实际应用价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种肺腺癌诊断试剂，所述肺腺癌诊断试剂能够检测肺腺癌样本中mirna和/或其前体的表达情况，或者mirna调控的靶基因的表达，检测所述mirna选自下列中的一种或几种：mir-6087、mir-7976、mir-7705、mir-6744-5p。优选的，所述mirna为mir-7705或mir-6744-5p或二者的组合。优选的，所述mirna为mir-7705、mir-6744-5p和mir-6087的组合。所述mir-6087序列见序列表seqidno1，其前体mir-6087序列见序列表seqidno2；所述mir-7976序列见序列表seqidno3，其前体mir-7976序列见序列表seqidno4；所述mir-7705序列见序列表seqidno5，其前体mir-7705序列见序列表seqidno6；所述mir-6744-5p序列见序列表seqidno7，其前体mir-6744-5p序列见序列表seqidno8。所述的样本为肿瘤组织或外周血。进一步，肺腺癌诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测肺腺癌样本中mirna和/或其前体的转录或基于免疫方法检测肺腺癌样本中其成熟mirna调控的靶基因的表达情况。优选采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测肺腺癌样本中mirna和/或其前体的转录。优选的，所述的用于定量pcr方法包括特异性扩增mirna和/或其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mirna和/或其前体的核酸序列杂交的探针。进一步，扩增mir-6087的引物为序列seqidno9；扩增mir-7976的引物为序列seqidno10；扩增mir-7705的引物为序列seqidno11；扩增mir-6744-5p的引物为序列seqidno12。本发明的目的还在于提供上述mirna和/或其前体在制备肺腺癌诊断工具中的应用。本发明的目的在于提供一种治疗肺腺癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物下调mir-7705或mir-6744-5p的转录和/或抑制mir-7705或mir-6744-5p成熟mirna的活性；(b)药剂学上能接受的载体。进一步，采用反义寡核苷酸、antagomirs、mirna海绵、mirnaerasers、targetmasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-7705或mir-6744-5p的转录和/或阻断mir-7705或mir-6744-5p的活性。本发明的目的在于提供一种治疗肺腺癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物上调mir-6087或mir-7976的转录和/或促进mir-6087或mir-7976成熟mirna的活性；(b)药剂学上能接受的载体。进一步，采用基于rna的microrna功能获得性技术和/或基因特异性mirmimics技术上调mir-6087或mir-7976的转录和/或促进其成熟mirna的活性。优选人工合成mir-6087或mir-7976成熟mirna的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或通过调控启动子上调mir-6087或mir-7976。定义：现阶段检测mirna的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于pcr的mirna检测方法。基于探针杂交技术的mirna检测方法是一种直接检测法，不需要对样本rna进行预扩增，包括northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。(1)northern杂交又称rna印迹技术为最经典的检测真核生物rna大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定mirna样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶mirna序列互补的dna探针，然后与经过标记的样本mirna杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。(2)mirna表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上mirna基因及内参序列，可精确分析出样品中相应mirna的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又称多功能悬浮点阵(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。(3)核酶保护分析技术(rpa)mirna的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测rna样本混合，热变性后杂交，未杂交的rna和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的rna分子，最后通过变性page电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知mirna。(4)rake法rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基础上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna与固定的dna探针杂交的方法。rake可以敏感特异地检测mirna，适用于大量快速的筛选所有己知的mirna。能够在特定的细胞和肿瘤中检测mirna表达谱情况。不仅如此，rake法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出mirna并对其进行分析，为从存档标本中分析mirna开启了希望之门。(5)原位杂交(insituhybridization)原位杂交技术可直观了解mirna表达方式，是观测mirna时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是当前应用较多的探针方式。(6)基于微球的流式细胞术(bead-basedflowcytometry)是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。(7)实时荧光定量pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)荧光检测pcr仪可对整个pcr过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的pcr循环数(一般用特定阈值循环数ct来表达)越少。由于mirna长度仅为22nt，传统的qrt-pcr不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于mirna的实时定量pcr方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的mirna检测qrt-pcr方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测mirna为模板逆转录合成cdna第一链，该cdna一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cdna的长度，随后以合成的cdna为模板设计引物进行实时定量pcr扩增。qrt-pcr具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。(8)测序法大部分已知的mirna都是通过cdna克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建mirna的cdna文库，再进行pcr扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。takada开发了一种改进的扩增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cdna链的3’末端。当5’端接头与cdna链的poly(c)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cdna的pcr扩增。由于mrap高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中mirna的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(sage)技术的基础上发展了检测效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个mirna，明显提高了检测效率。高通量测序(high-throughputsequencing)又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid测序仪(abisolidsequencer)。基于rna的microrna功能获得性技术即通过外源性补充mirnas合成的前体物质来升高mirnas的水平。例如，可以人工合成与内源性mirna序列一致的短发夹样rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做启动子，以病毒为载体转染细胞，被dicer酶修饰后载入risc发挥作用，相当于升高pre-mirna的水平，作用效果稳定而持久。基因特异性mirmimics技术该技术避免了mirna与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’utr互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与mirna相同的转录后调节作用。包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearicacidmagnesium)及矿物油(mineraloil)等，但并非局限于此。本发明的药剂学组合物根据本发明所属
技术领域：
的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。附图说明图1是mir-6087、mir-7976分别诊断肺腺癌的roc曲线图图2是mir-7705、mir-6744-5p分别诊断肺腺癌的roc曲线图图3是mir-7705和mir-6744-5p联合诊断肺腺癌的roc曲线图图4是三种mirna联合诊断肺腺癌的roc曲线图具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。实施例1样品的收集4例肺腺癌组织及癌旁组织均来自北京友谊医院2015年1月-2016年7月手术切除的标本，所有标本均在离体10分钟以内放入液氮罐中，随后转移至-80℃冰箱中储存。实施例2总rna提取1提取方法1)取80mg组织块，加入800μllysis/binding缓冲液，使用匀浆器对组织块进行匀浆。匀浆的过程中样品要置于冰上保持低温状态。2)再加入1/10体积homogenateadditive到上述已经匀浆的组织样品中，冰上放置10min。3)加入与lysis/binding缓冲液等量体积的水饱和酚，震荡45s,10,000×g室温离心5min。4)小心取出上清到新的试管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，混匀后，移入纯化柱中，10,000×g，离心15s，倒掉收集管中的液体。由于柱子的最大的体积只有700μl，因此重复此步操作，直到所有的上清都过滤完成。5)向离心柱子中加入700μlmirna洗脱液1，室温，10,000×g，离心15s,倒掉收集液，换用新的收集管。6)再用500μl洗脱液2/3加入离心柱中，10,000×g，离心10s，重复这一步骤一次。7)离心1min，10,000×g，弃去多余的液体。8)将上述液体转移到新的离心管，加100μl95℃预热的depc处理30s，10,000×g，离心。9)使用nanodrop测定rna浓度和260nm/280nm的比值。10)得到的rna保存于-80℃冰箱。2提取标准测定rna浓度和260nm/280nm的比值：总rna的纯度要求是od260/od280值应在1.8至2.2之间；rna完整性的检测：用1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性；根据测序公司的要求，小rna测序总量3μg以上，浓度在300ng/μl以上。实施例3测序及数据分析由测序公司进行测序文库的建立及上机测序，所使用的测序仪为illumina公司的hiseq2000测序仪。根据测序公司提供的数据进行统计学分析，fdr<0.001，log2(fc)绝对值>1，两组count平均值之差大于100。对差异表达mirna人为挑选过滤中差异表达明显的mirna，几个之前从未被报道过的与肺腺癌相关的分子标志物进入我们的研究范围，其中mir-6087、mir-7976在癌组织中表达低于癌旁组织，mir-7705、mir-6744-5p在癌组织中的表达量高于癌旁组织。实施例4real-timepcr检测肺腺癌外周血样本中mirna的表达1样品采集：32例肺腺癌病人外周血样本和24例健康对照外周血样本均来自北京友谊医院，患病组均是经过病理检测确诊。2mirna提取：使用sigma公司的genelutetm血浆/血清rna小量纯化试剂盒(产品编号rnb500)，具体操作参照试剂盒操作说明书。3mirna逆转录表1rt体系组分浓度体积(μl)totalrna-1μgmiscripthispecbuffer5×4nucleicsmix10×2miscriptreversetranscriptasemix-2nuclease-freeh2o-补平至20abi9700型pcr仪上37℃保温60min使逆转录反应完全后，95℃5min终止反应。加入80μlnuclease-freeh2o稀释至100μl储存在-20℃冰箱，用于后续实验。4荧光定量pcr表2rt-pcr体系mirnas的表达检测每次设置3个平行管反应，microrna-specificprimer引物见表3，以通用的snrnau6作为内参。表3microrna-specificprimer引物引物名称编号序列mir-6087引物seqidno9tgaggcgggggggcgagcmir-7976引物seqidno10tgccctgagacttttgctcmir-7705引物seqidno11aatagctcagaatgtcagttctgmir-6744-5p引物seqidno12tggatgacagtggaggcctpcr程序：95℃10min；40个循环(95℃10s，60℃30s)。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。5统计学分析采用originpro8.1软件进行分析。统计方法均数间比较采用t检验，p<0.05(差异显著)和p<0.01(差异非常显著)定为有统计学意义。结果显示与健康对照相比，肺腺癌组mir-7705和mir-6744-5p显著升高，分别约为对照组的2.5倍和4.7倍，而mir-6087和mir-7976略有降低，分别为对照组的0.65倍和0.6倍。rt-pcr结果与高通量数据分析结果一致。实施例5诊断效能的评价分析对于单个mirna分子或是诊断模型的效能评价的方法为建立受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线，通过计算曲线下面积(areaundercurve)来判断诊断的能力。我们将tcga数据库中有关肺腺癌的数据下载，获得数据集(包括46例对照组和519例病例组)，进而进行分析，结果显示，mir-6087、mir-7976、mir-7705和mir-6744-5p诊断肺腺癌的auc为0.452、0.460、0.755和0.318(见图1和图2)，除mir-7705和mir-6744-5p联合诊断肺腺癌的auc为0.813外(见图3)，其他mir-7705和其他mirna的组合auc值均小于单独mir-7705的auc值，mir-7705、mir-6744-5p和mir-7976联合诊断肺腺癌的auc为0.744(见图4上)，mir-7705、mir-6744-5p和mir-6087联合诊断肺腺癌的auc为0.768(见图4下)。mir-6087、mir-7976、mir-7705和mir-6744-5p联合诊断肺腺癌的auc为0.725。分析表明mir-7705和mir-6744-5p联合诊断肺腺癌具有叠加效果。虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技术有限公司<120>肺腺癌相关的mirna、组合物及其应用<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>rna<213>人工序列<400>1ugaggcgggggggcgagc18<210>2<211>49<212>rna<213>人工序列<400>2ggugaggcgggggggcgagcccugaggggcucucgcuucuggcgccaag49<210>3<211>19<212>rna<213>人工序列<400>3ugcccugagacuuuugcuc19<210>4<211>66<212>rna<213>人工序列<400>4ugcccugagacuuuugcucuaauaauuuauucuaauaauaauuuagaucaaaagccucag60ggcaga66<210>5<211>23<212>rna<213>人工序列<400>5aauagcucagaaugucaguucug23<210>6<211>57<212>rna<213>人工序列<400>6aauagcucagaaugucaguucuguuuuaaguaacagaauugauaacugagcaaggaa57<210>7<211>19<212>rna<213>人工序列<400>7uggaugacaguggaggccu19<210>8<211>66<212>rna<213>人工序列<400>8ucacguggaugacaguggaggccuccuggaucucuaggucucagggccucucuugucauc60cugcag66<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<400>9tgaggcgggggggcgagc18<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10tgccctgagacttttgctc19<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11aatagctcagaatgtcagttctg23<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12tggatgacagtggaggcct19当前第1页12