一种用于扩增SMN1基因的PCR引物对和用于检测SMN1基因点突变的试剂盒的制作方法

本发明涉及遗传病基因检测领域，更具体地，涉及一种用于扩增smn1基因的pcr引物对和用于检测smn1基因点突变的试剂盒。

背景技术：

脊髓性肌萎缩(sma)是一种遗传性神经肌肉遗传病，临床表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩、呼吸衰竭，是发病率第二高的致死性常染色体隐性遗传病。目前尚无有效的治疗方法。sma在活产婴儿中发病率约为1/6000～1/10000，人群中的携带率为1/35～1/80，最新的报道称中国人群的携带率为1/42。sma最主要的致病基因是运动神经元存活基因(smn)，该基因突变导致脊髓前角细胞(脊髓运动神经元)退化、变性，使得患者肌肉日渐萎缩。smn基因定位于5q13区，具有两个高度同源的基因拷贝：smn1和smn2。smn1基因表达完整而稳定的smn功能蛋白，是sma的决定性基因，smn1基因缺陷造成sma表型；smn2基因与smn1基因序列高度相似，仅存在5个碱基的差异，分别位于第7、8外显子和第6、7内含子中，其中第7外显子上的c/t的差异，导致smn2在初级转录产物pre-mrna剪切加工时发生外显子跳跃，产生的mrna较smn1缺失第7外显子；研究表明，只有10％-15％的smn2基因能表达为全长的smn蛋白，因此也被成为sma的补偿基因。已有统计表明，约95％的sma患者为smn1基因纯合缺失型(第7和/或第8外显子纯合缺失)，约5％为smn1基因杂合缺失型(第7和/或第8外显子杂合缺失)与点突变形成复合杂合突变所致。

根据sma的致病基因特点，现有的基因诊断技术主要是分析smn1基因第7外显子是否有缺失及缺失数目，不适合用于检测smn1基因点突变(包括错义、无义、移码、剪切位点突变)。对于点突变的检测，由于smn1存在高度同源的smn2基因且基因体长达32kb，常规的pcr-sanger测序方法难以避免smn2基因的干扰，给点突变的检测带来了极大的困难。目前通常采用的方法有两种：(1)通过提取总rna，然后利用smn1特异性引物反转录cdna，再进行pcr-sanger测序；(2)应用这两个基因在第8外显子和第6内含子差异性位点，设计特异性引物，分析第7、8外显子的序列突变情况。这两种方法前期处理的工作量大，程序复杂耗费大量人力，成本高昂，效率低下；并且不能分析剪切位点突变，第二种方法只能检测第7、8外显子突变。

因此，本领域仍然需寻求一种新的检测smn1基因点突变的方法，提高诊断准确率，简化操作流程，提高时效性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于扩增smn1基因的pcr引物对和用于检测smn1基因点突变的试剂盒。利用本发明的smn1特异性引物，首先特异性扩增smn1超长片段，然后以长片段pcr产物为模板进行巢式pcr、对smn1基因的全部外显子扩增，以实现对smn1基因点突变的检测。

根据本发明，长片段pcr(longrange-pcr，lr-pcr)是指扩增长度大于5kb的pcr，与常规的短片段pcr相比，最大的区别在于，其受dna模板的二级结构、引物的特异性和退火温度、以及不理想的循环条件等因素影响较大，以至于超长片段pcr的扩增难度较大。

为了保证扩增的特异性，只扩增smn1真基因，设计引物时，首先比对smn1基因和smn2基因及上下游序列，寻找差异性位点；在该位点设计特异性扩增的上下游引物；为了进一步提高扩增的特异性，降低错配发生的概率，在差异性位点采用锁核酸(lna)修饰核苷酸。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于扩增smn1基因的pcr引物对，该pcr引物对包括具有seqidno：1所示碱基序列的引物和具有seqidno：2所示碱基序列的引物：

5'-gtgtttaaggatctgccgcct-3'(seqidno：1)

5'-cgtggctgaggcacgagaacc-3'(seqidno：2)

其中，seqidno：1中位于3’端第2-4位的碱基、seqidno：2中位于5’端第6位和3’端第1位的碱基均为锁核酸修饰。

本领域技术人员公知，锁核酸(lockednucleicacid，lna)是一种寡核甘酸衍生物，和普通寡核甘酸分子区别在于其结构中含有一个或多个2’-o，4’-c-亚甲基-β-d-呋喃核糖核甘酸单体，核糖的2’-o位和4’-c位通过亚甲基桥连接起来，成环形。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种用于检测smn1基因点突变的试剂盒，该试剂盒包括：上述pcr引物对，以及pcr反应用试剂。

根据本发明，优选地，该试剂盒还包括：扩增smn1基因全部外显子的引物组。

所述扩增smn1基因全部外显子的引物组优选包括具有seqidno：3～seqidno：18所示碱基序列的引物。

根据本发明，优选地，所述pcr反应用试剂包括以下组分中的至少一种：mgcl2、dmso、高保真、高效率的dna聚合酶、dntps和pcr反应缓冲液。。

所述高保真、高效率的dna聚合酶为扩增效率高、高保真性、延伸性能好、适用于gc含量高的dna聚合酶。

其中，各组分可以以存储液的形式提供。优选地，所述的mgcl2存储液浓度为100mmol/l。所述的dntps存储液浓度为10mmol/l。

应用本发明的试剂盒，采用锁核酸引物和超长片段pcr扩增可以检测smn1基因点突变，检测结果的精确和可靠，可重复性好，并且可操作性强。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本发明示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。

图1示出了smn1特异性引物的设计原理。以人类基因组(hg38)chr5:70924473_70953280序列为参考序列，覆盖smn1基因全部外显子及毗邻区域。

图2示出了4个样本的超长片段pcr产物的电泳结果。目的条带大小为28808bp，电泳结果与预期一致。

图3示出了以长片段pcr为模板，针对各外显子pcr-琼脂糖凝胶电泳图。pcr产物电泳结果与预期一致。

图4示出了第7外显子及其侧翼的测序经长片段pcr结合巢式pcr-sanger测序，测序结果证实长片段pcr扩增的特异性，只扩增了真基因-smn1基因，未扩增smn2基因。

图5示出了巢式pcr-sanger测序的结果。样本1为smn1基因第7外显子缺失和c.683t>a(p.leu228ter)杂合突变；样本2为smn1基因第7外显子缺失和c.280g>t(p.val94phe)杂合突变。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然附图中显示了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例1

样本：同时携带smn1基因第7-8外显子杂合缺失与杂合点突变的sma患者样本2例；正常人样本2例。

1、提取待检测的样本全基因组dna；

使用omega“基因组dna抽提试剂盒”提取外周血dna，同时去除rna。提取的dna总体积约为100μl，浓度在20-200ng/μl；a260/280在1.8-2.0之间。

2、超长片段pcr扩增覆盖smn1基因全部外显子的片段

pcr扩增试剂选用kodfxneo(东洋纺，toyobolifescience)dna聚合酶，以基因组dna为模板最大可扩增40kb的片段，具有高扩增效率、高保真性的特点。(各反应组分如表1所示)。

表1.pcr反应体系

扩增程序：

pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段大小与预期目的片段大小一致(如图2所示)。

3、以长片段pcr产物为模板，经巢式pcr扩增每一个外显子

以长片段pcr产物稀释500倍作为dna模板，用每一对引物对各外显子扩增。

pcr实验选择天根生化科技highaffinityhotstarttaq试剂盒(et108)。在pcr反应体系中，加入缓冲液、dntps、dna聚合酶、引物、模板dna、h2o。为减少人为误差，简化操作流程，首先将pcr扩增试剂配置成mix(包括habuffer、dntps、h2o、hotstarttaq)，然后分别与不同突变的特异性引物对混匀，分装至每个反应孔；最后加入不同样本dna(各反应组分如表2所示)。

表2pcr反应体系

pcr扩增程序为：变性：95℃分钟；pcr循环扩增：95℃变性15秒，62℃，退火20sec，72℃延伸30sec，共25个循环；接着72℃继续延伸5min。为了针对每一对引物摸索、优选合适的pcr条件。pcr结束后，经琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物为预期大小的、明亮的单一条带(如图3所示)。

4、pcr产物一代测序

pcr产物纯化后采用abi公司bigdye3.1测序试剂盒，在abi公司3130xl基因测序仪上对产物直接进行双向测序，用chromas软件将测序结果与genebank中的正常参考序列进行比对分析，确定基因突变位点。

结果分析

首先，针对smn1基因和smn2基因存在差异的5个位点分析，以确保长片段pcr扩增产物为真基因-smn1基因。这5个差异性位点，有4个位点位于对第7外显子及其侧翼序列，因此通过比对分析第7外显子及其侧翼的测序结果，如图4所示，4个差异性位点均为smn1基因特有的，证实了长片段pcr扩增的特异性。

然后，将巢式pcr-sanger测序结果与smn1基因参考序列(nm_000344)比对，分析各个外显子的序列变异情况。如图5所示，样本1为smn1基因第7外显子缺失和c.683t>a(p.leu228ter)杂合突变；样本2为smn1基因第7外显子缺失和c.280g>t(p.val94phe)杂合突变。采用本发明的试剂盒，利用超长片段pcr结合巢式pcr-sanger测序得到的结果与rna逆转录-cdna测序的结果是一致的，说明利用本发明的试剂盒进行点突变检测可行、可靠，并且可操作性强。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

sequencelisting

<110>郑州大学第一附属医院

<120>一种用于扩增smn1基因的pcr引物对和用于检测smn1基因点突变的试剂盒

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