本发明属于食品安全领域，具体为一种乳制品中粘红酵母的检测探针及基因芯片和方法，将基因芯片技术应用于乳品污染微生物的分类鉴定。
背景技术：
乳制品是一种营养丰富，容易被消化和吸收的天然食品，随着人们生活水平的提高，已经成为生活中常见的食品。但是营养丰富的乳制品也是各种微生物青睐的温床，这导致乳制品的货架期非常有限，比如经巴氏灭菌的乳制品保质期一般不超过7天（巴氏鲜奶占全球液态奶70%的市场份额），近些年市场占有量越来越大的发酵酸奶，其保质期一般也只有21天。
另一方面，国家《食品安全法》和《企业生产乳制品许可条件审查细则（2010版）》中明确要求企业必须对所生产、加工的乳制品进行出厂前微生物检验，包括5种指示菌和5种致病菌的检测。目前乳制品企业基本都是采用传统的平板培养法来检测微生物，这种方法的检测周期一般在3~4天左右，甚至有些致病菌不能仅凭菌落形态来判定，需要配合其他生化反应试验做进一步鉴定，这无疑又增加了检测周期。因此，较长的检测周期（完成国标要求检测的10种微生物需要5~6天）和较短乳制品保质期（营养物质没有被破坏的巴氏灭菌乳制品的货架期只有7天）之间形成了矛盾，这一矛盾已成为制约乳制品企业发展的重要瓶颈，也成为制约市场终端能获取到营养最全面乳制品的重要因素。
基因芯片是dna识别技术的一种体现，利用芯片高通量的优势，可以在一张芯片上同时对多个物种的多个dna条形码进行检测，不仅极大地提高了鉴定的准确性，而且还大大缩短了检测周期，即利用基因芯片可以在短时间内对微生物多个dna靶点进行检测。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种乳制品中真菌粘红酵母dna检测芯片的制备方法，通过该基因芯片能够在短时间内对粘红酵母的两个dna片段进行定性定量检测。本发明内容涉及乳制品中微生物核酸提取、pcr引物设计及扩增、基因芯片的制备及杂交检测。
本发明是采用如下技术方案实现的：
本发明技术方案之一为，乳制品中粘红酵母的检测探针，包括：
粘红酵母its的检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’；
粘红酵母tubb的检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’。
本发明技术方案之二为，乳制品中粘红酵母的检测基因芯片，包括如上所述的2个检测探针。
本发明技术方案之三为，乳制品中粘红酵母的检测方法，包括如下步骤：
（1）、靶序列的确定：
真菌粘红酵母的特异性检测靶序列分别为：
粘红酵母its：
aaggatcattagtgaatctaggacgtccaacttaacttggagtccgaactctcactttctaaccctgtgcatctgttaattggactagtagctcttcggagtgaaccgccattcacttataaacacaaagtctatgaatgtatacaaatttataacaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacccacctctttcttagtgaatctggtggtgcttggtttctgagcgctgctctgcttcggcttagctcgttcgtaatgcattagcatccgcaaccgaacttcggattgacttggcgtaatagactattcgctgaggattctagtttactagagccgagttgggttaaaggaagctcctaatcctaaagtctatttttttgattagatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaa；
粘红酵母tubb：
ggcgccgagctcgtcgactcgatcctcgaccagctgcaccacgagaccgaggcgtgcgacacgctgcagggcttccagatggtgcactcggtcggcggcgggaccgggtcggagctcgggacgctcatcctcagcaagatccgcgaggaggtgcgtctctgcggctctctctcgcttatctctctgctgttccccgtcgatggtcgatcggtgacgctctagcactcgcctgcagttccccgaccgcatgctcgcgacctactcgggtgtgccgtcgcccaaggtgtgcgagaccgtcgtcgagccgtacacagccatcctgtcgtaccaccagctcatcgagaaccgcgacatggtctttgcgttcgacaacgaggcgctgtacgacatcatggcgcgcaccgtcaaggtgtcaaacccggcgtacgcgcagctcaacggcctcatcacaaaggtcatgagcggcatcacgacgccgttgcggttcccgggccagctcaactc。
（2）、引物与探针的设计：
靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下：
粘红酵母its：
引物1：5’cy3—aaggatcattagtgaatctagg—3’
引物2：5’—gttcagcgggtagtcctacctg—3’
检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’；
粘红酵母tubb：
引物1：5’cy3—ggcgccgagctcgtcgactcg—3’
引物2：5’—gagttgagctggcccgggaac—3’
检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’。
（3）、模板提取：将乳品置于-80℃速冻15min，取出后置于研磨中，在液氮环境下将其整体研磨成粉末状，用ctab方法提取粉末中的核酸。
（4）、rt-pcr扩增及荧光标记：
用已经荧光标记的引物对步骤（3）所提取的模板进行rt-pcr扩增。
（5）、芯片制备：
将氨基化的探针点在醛基片基上，室温放置过夜，先后用洗脱液i、洗脱液ii洗脱，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用；
进一步的，为了验证所制备芯片的准确性，在片基上固定另外两种乳制品污染真菌罗伦氏隐球酵母、烟曲霉相关基因的检测探针，以作为阴性对照使用。
（6）、分子杂交：将步骤（4）的pcr产物与步骤（5）制备好的芯片进行原位杂交，在42℃下保持40min，用洗脱液i、洗脱液ii洗脱。
（7）、结果分析：用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果。
本发明具有对乳制品常见感染真菌粘红酵母进行dna检测的基因芯片，利用基因芯片的特异性、时效性在短时期内对粘红酵母进行检测和鉴定，针对同一种微生物设计2个检测靶点，解决了微生物种间亲缘关系近、dna序列同源性高而导致的检测特异性低的问题，提高了种间微生物检测的准确性。
本发明具有对罗伦氏隐球酵母、烟曲霉、粘红酵母三种乳制品常见感染真菌进行dna检测的基因芯片，利用基因芯片的高通量检测特点。
本发明具有的有益效果如下：
1、准确性：基于dna和rna的检测，结果更可靠。
2、时效性：相比于传统培养法鉴定耗时3~4天，本发明只需要6小时即可完成3种乳制品感染微生物的鉴定。
3、可靠性：每种污染微生物设计两个检测靶点，提供了检测的准确性。
本发明公开了乳制品中真菌dna检测芯片的制备方法，通过该基因芯片能够在短时间内粘红酵母rhodotorulaglutinis进行定性定量检测。本发明方法适用于奶源样品、生产中间品、成品等全工艺链上的乳品检测，在大幅缩短乳品货架期的同时还可以提供一种生产过程质控的新型检测方法。
附图说明
图1表示为粘红酵母的双重靶点检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
一种乳制品中粘红酵母的检测方法，包括如下步骤：
（1）、靶序列的确定：
根据报道的粘红酵母its和tubb基因序列，各选择一段特异性较好、片段长度适合的基因序列作为检测的靶序列，如下：
粘红酵母its：
aaggatcattagtgaatctaggacgtccaacttaacttggagtccgaactctcactttctaaccctgtgcatctgttaattggactagtagctcttcggagtgaaccgccattcacttataaacacaaagtctatgaatgtatacaaatttataacaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacccacctctttcttagtgaatctggtggtgcttggtttctgagcgctgctctgcttcggcttagctcgttcgtaatgcattagcatccgcaaccgaacttcggattgacttggcgtaatagactattcgctgaggattctagtttactagagccgagttgggttaaaggaagctcctaatcctaaagtctatttttttgattagatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaa；
粘红酵母tubb：
ggcgccgagctcgtcgactcgatcctcgaccagctgcaccacgagaccgaggcgtgcgacacgctgcagggcttccagatggtgcactcggtcggcggcgggaccgggtcggagctcgggacgctcatcctcagcaagatccgcgaggaggtgcgtctctgcggctctctctcgcttatctctctgctgttccccgtcgatggtcgatcggtgacgctctagcactcgcctgcagttccccgaccgcatgctcgcgacctactcgggtgtgccgtcgcccaaggtgtgcgagaccgtcgtcgagccgtacacagccatcctgtcgtaccaccagctcatcgagaaccgcgacatggtctttgcgttcgacaacgaggcgctgtacgacatcatggcgcgcaccgtcaaggtgtcaaacccggcgtacgcgcagctcaacggcctcatcacaaaggtcatgagcggcatcacgacgccgttgcggttcccgggccagctcaactc。
（2）、引物与探针的设计：
靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下：
粘红酵母its：
引物1：5’cy3—aaggatcattagtgaatctagg—3’
引物2：5’—gttcagcgggtagtcctacctg—3’
检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’
粘红酵母tubb：
引物1：5’cy3—ggcgccgagctcgtcgactcg—3’
引物2：5’—gagttgagctggcccgggaac—3’
检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’。
（3）、模板提取：
将2ml乳品置于-80℃速冻15min，取出后置于研磨中，在液氮环境下将其整体研磨成粉末状，用ctab方法提取粉末中的核酸。
（4）、rt-pcr扩增及荧光标记：
用已经荧光标记的引物对步骤（3）所提取的模板进行rt-pcr扩增，采用天根生化科技有限公司的一步法rt-pcr进行扩增，扩增体系如下：
pcr反应条件为：42℃保温30min，95℃预变性3min，重复95℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸30sec这变性—复性—延伸三个过程36个循环，最后在72℃保温5min。
（5）、芯片制备：将氨基化的探针按一定浓度（浓度为50pmol/ul）点在醛基片基上，室温放置过夜，先后用洗脱液i（5×ssc，1%sds）、洗脱液ii（0.25×ssc，1%sds）各洗脱5min，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用。
为了验证所制备芯片的准确性，在片基上固定了另外两种乳制品污染真菌罗伦氏隐球酵母、烟曲霉相关基因的检测探针，以作为阴性对照使用。
探针固定方法同上，具体探针如下：
罗伦氏隐球酵母its的检测探针：
5’nh3—tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg—3’；
罗伦氏隐球酵母rpb
5’nh3—ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg—3’；
烟曲霉its的检测探针：
5’nh3—ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag—3’；
烟曲霉abr
5’nh3—ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg—3’；
（6）、分子杂交：
将步骤（4）的pcr产物与步骤（5）制备好的芯片进行原位杂交，在42℃下保持40min，用洗脱液i（5×ssc，1%sds）、洗脱液ii（0.25×ssc，1%sds）各洗脱5min。
（7）、结果分析：
用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果，结果如图1所示。
图中，cl-its为罗伦氏隐球酵母的its检测位点，显示为阴性；cl-rpb
图中，af-its为烟曲霉的its检测位点，显示为阴性；af-abr
图中，rg-its为粘红酵母的its检测位点，显示为阳性；rg-tubb为粘红酵母的tubb基因检测位点，显示为阳性。
以上仅为本发明的具体实施例，但并不局限于此。任何以本发明为基础解决基本相同的技术问题，或实现基本相同的技术效果，所作出地简单变化、等同替换或者修饰等，均属于本发明的保护范围内。
说明书核苷酸和氨基酸序列表
粘红酵母its：
aaggatcattagtgaatctaggacgtccaacttaacttggagtccgaactctcactttctaaccctgtgcatctgttaattggactagtagctcttcggagtgaaccgccattcacttataaacacaaagtctatgaatgtatacaaatttataacaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacccacctctttcttagtgaatctggtggtgcttggtttctgagcgctgctctgcttcggcttagctcgttcgtaatgcattagcatccgcaaccgaacttcggattgacttggcgtaatagactattcgctgaggattctagtttactagagccgagttgggttaaaggaagctcctaatcctaaagtctatttttttgattagatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaa；
粘红酵母tubb：
ggcgccgagctcgtcgactcgatcctcgaccagctgcaccacgagaccgaggcgtgcgacacgctgcagggcttccagatggtgcactcggtcggcggcgggaccgggtcggagctcgggacgctcatcctcagcaagatccgcgaggaggtgcgtctctgcggctctctctcgcttatctctctgctgttccccgtcgatggtcgatcggtgacgctctagcactcgcctgcagttccccgaccgcatgctcgcgacctactcgggtgtgccgtcgcccaaggtgtgcgagaccgtcgtcgagccgtacacagccatcctgtcgtaccaccagctcatcgagaaccgcgacatggtctttgcgttcgacaacgaggcgctgtacgacatcatggcgcgcaccgtcaaggtgtcaaacccggcgtacgcgcagctcaacggcctcatcacaaaggtcatgagcggcatcacgacgccgttgcggttcccgggccagctcaactc。
粘红酵母its：
引物1：5’cy3—aaggatcattagtgaatctagg—3’
引物2：5’—gttcagcgggtagtcctacctg—3’
检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagcc—3’
粘红酵母tubb：
引物1：5’cy3—ggcgccgagctcgtcgactcg—3’
引物2：5’—gagttgagctggcccgggaac—3’
检测探针：
5’nh3—ttttttttttttcagcgtgtcgcacgcctcggtctcgtg—3’
罗伦氏隐球酵母its的检测探针：
5’nh3—tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg—3’
罗伦氏隐球酵母rpbi的检测探针：
5’nh3—ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg—3’
烟曲霉its的检测探针：
5’nh3—ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag—3’
烟曲霉abrii的检测探针：
5’nh3—ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg—3’