专利名称：一株粘红酵母及其制备(s)-羟基丙酰胺的方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株粘红酵母以及应用该菌种转化 N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生产抗抑郁药度洛西汀的关键手性中间体(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法。
背景技术：
度洛西汀是第三代抗抑郁药，是市场销售最主要的抗抑郁药，能有效地抑制5-羟色氨和去甲肾上腺素的再摄取(Wong D T et al. Life ki，1988，43 :2049-2057.)，高效，安全，副作用小，对其他症状如全身疼痛和胃肠道紊乱也有疗效(Bymaster FP et al. Neuropsychopharmacology,2001,25 :871-880.)。该药还被批准用于糖尿病引起的神经疼痛以及女性尿失禁的治疗(Norton PA et al. Am J Obstet Gynecol，2002，187 :40-48.)。 2007年，其全球销售额已达到21亿美元，较前一年增长60%，2008年，其全球销售额为30 亿美元，市场预计其销售额将继续大幅增长。度洛西汀含有一个手性中心，研究表明仅⑶构型的对映体具有药物活性。 (S)-度洛西汀的合成关键步骤为(S)构型手性醇中间体的获得。目前对(S)构型手性醇中间体的获得主要通过化学途径，但存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，由于产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致其难以应用于医药中间体的生产。与化学方法相比，生物催化过程具有高度的化学、区域和立体选择性，反应条件温和，后处理容易，能耗较低，是一种环境友好的合成方法，也是当今化工生产和相关领域发展一大潮流。其中生物催化不对称还原已经发展成为全球各大医药公司研发部门的重要组成部分(Carballeira JD et al. Biotechnology Advances，2009，27 :686-714.)。如先灵葆雅公司系统研究了 300多种菌株催化的数十种苯基酮为骨架的底物的不对称还原；默克公司对含氟苯基酮的不对称还原研究。然而，迄今为止的绝大部分研究集中于苯基酮为骨架的底物，而以杂芳环酮为骨架的底物研究较少见，其中与度洛西汀手性中间体合成相关的更是屈指可数(Wada M, etal. Biosci Biotechnol Biochem，2004，68 1481-1488 ； Sturmer R, et al. US, 2008,0318288A1)。Soni 等人2005年报道的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)催化的(S)-度洛西汀关键醇中间体合成，虽然该生物转化在底物浓度为Ig/ 1时，能以高的转化率以及高的对映体过量得到(S)-度洛西汀关键醇中间体，但是该微生物菌株的转化率和对映体过量均会随着底物浓度的增加而迅速降低，该弊端严重阻碍其在(S)-度洛西汀工业生产的应用。使用醇脱氢酶进行不对称还原，如Exiguobacterium sp. F42中的短链脱氢酶以及ThermoanaercAacter中的醇脱氢酶，虽然能有效的获得-度洛西汀关键醇中间体，但这两种方法必须外加昂贵的辅酶NADH或NADPH，使得 (S)-度洛西汀关键醇中间体的生产成本大大提高，该弊端阻碍这两种方法在(S)-度洛西汀关键醇中间体工业生产的应用(ada, M. ；Yoshizumi, A. ；Furukawa, Y. ；Kawabata, H.； Ueda, M. ；Takagi, H. ；Nakamori, S.Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004,68 :1481-1488.；Breuer, M. W02007074060A1)。(S) -N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺是(S)-度洛西汀的一种关键醇中间体，目前，尚未有微生物转化制备该关键手性醇中间体的报道。
发明内容
本发明的目的是公开一种粘红酵母，该菌于2010年7月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2010180，分类命名粘红酵母Iihodotorula glutinis CY12，并利用该菌具有生产高活力、高对映选择性的羰基还原酶的特性，还原底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺制备光学纯(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，该( 型产物是合成抗抑郁药度洛西汀的关键手性中间体。本发明粘红酵母(Rhodotorulaglutinis CY12, CCTCC M 2010180)的筛选方法 利用休止细胞全细胞生物转化的方法，从中科院成都生物研究所保藏的38株微生物中筛选能够将底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺转化为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的菌株，并将转化率最高且对映体过量值大于99%的菌株进行进一步的鉴定。经筛选得到本发明涉及的粘红酵母CY12。具体方案见实施例1和2。采用上述粘红酵母作为生物催化剂，转化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。具体方法如下1.菌株培养斜面保存培养基组分为胰蛋白胨1 % ；酵母提取物0. 5% ；NaCl 1 % ；琼脂粉2% ；酵母培养基组成为胰蛋白胨0.5% ；酵母提取物0. 15% ；牛肉膏0. 15% ；NaCl 0.5% ；葡萄糖； 以上含量均为质量/体积百分比，溶于去离子水，用NaOH调pH值为7. 0，105kPAa, 121°C，灭菌20分钟。斜面培养将筛选得到的红酵母接种于斜面保存培养基上，30°C培养48 60小时；种子培养将斜面培养的菌株，无菌条件下用接种环接种于约IOml液体酵母发酵培养基中，30°C培养24 36小时，制得种子液；摇瓶培养以0.4% 接种量将种子液接入新鲜的酵母液体培养基中，30°C， 230转/分钟，培养8 48小时。2.收集菌体取步骤(1)摇瓶培养的菌液在4°C、8000转/分钟条件下离心5 分钟，收集菌体，并用磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液 (0. 1M，pH 6. 0 8. 0)充分洗涤2次，得到湿菌体作为生物催化剂。3.生物转化实验将步骤( 中的生物催化剂湿菌体以上述缓冲液配成粘红酵母细胞浓度为50 300g/l的菌悬液，加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺(底物制备详见实施例1，底物溶于二甲亚砜)，终浓度为1 30g/l，添加的葡萄糖作为辅酶再生底物。转化条件为20 40°C，转速为200 280转/分，转化时间为4 44小时。4.分离样品用一倍体积的乙酸乙酯萃取两次，用无水硫酸钠干燥后，在旋转蒸发仪上减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯，最后用2 IOml异丙醇(HPLC^l)充分溶解即为备用检测样品。5. HPLC检测取步骤⑷中1 3μ 1样品进样，用普通色谱柱测定N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺及N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的含量，利用手性色谱柱测定(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺及(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的含量，最后计算出转化率和ee值。在上述方法中，检测转化率时色谱柱为hertsil SIL-100A 250X4. 6mm，流动相 正己烷异丙醇=70 30，流速lml/min，N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺和N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滞留时间分别为8. 921和13. 022min ；检测ee值时手性色谱柱为Daicel Chiralcel 0J-H250 X 4. 6mm，流动相正己烷异丙醇=90 10，流速 0. 5ml/min, (S)-N-甲基_3_羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺和(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滞留时间分别为22. 808和24. 176min。本发明的催化剂粘红酵母菌体易于制备，反应条件温和，产物收率在90%以上，ee 值99%以上，产物浓度高达27g/l，具有较好的工业应用前景。
图1是N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺标样手性HPLC图谱。1号峰为 (S) -N-甲基-3-羟基-3- (2-噻吩基)丙酰胺，2号峰为(R) -N-甲基-3-羟基-3- (2-噻吩基)丙酰胺。图2是实施例25利用粘红酵母菌体转化底物N-甲基_3_羟基_3_ (2_噻吩基) 丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺时，体系扩大到50ml，转化后的普通HPLC图谱。1号峰为N-甲基-3-氧-3- (2-噻吩基)丙酰胺，2号峰为N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。图3是实施例25利用粘红酵母菌体转化底物N-甲基_3_羟基_3_ (2_噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺时，体系扩大到50ml时，转化后的手性HPLC图谱。1号峰为⑶-N-甲基-3-羟基-3- (2-噻吩基)丙酰胺，2号峰为(R) -N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
具体实施例方式实施例1底物合成
权利要求
1.一种粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CY12，保藏号为CCTCC M 2010180。
2.权利要求1所述粘红酵母制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法， 其特征在于30°C培养粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CY12CCTCC M 2010180，至 8 48h，离心收集菌体，经磷酸盐缓冲液洗涤2次后，获得湿菌体作为生物催化剂，重悬于磷酸盐缓冲液制成菌悬液，转化体系中加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，并加入的葡萄糖作为辅酶再生底物，经生物转化获得产物(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
3.根据权利要求2所述的制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法， 其特征是所述磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，浓度为0. 1M，pH为6. O 8. O。
4.根据权利要求2所述的制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法， 其特征是生物转化的温度为20 40°C，转速为200 280转/分，转化时间为4 44小时。
5.根据权利要求2所述的制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法，其特征是转化体系中粘红酵母细胞浓度以湿重计为50 300g/l，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺浓度为1 30g/l。
全文摘要
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株粘红酵母以及应用该菌种转化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生产抗抑郁药度洛西汀的关键手性中间体(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法。本发明粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)CY12，保藏号为CCTCCM2010180。用本发明粘红酵母在30℃温度下培养8~48小时，离心收集菌体，经磷酸盐缓冲液洗涤2次后，获得湿菌体作为生物催化剂，重悬于磷酸盐缓冲液制成菌悬液，转化体系中加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，并加入1%的葡萄糖作为辅酶再生底物，经生物转化获得产物(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。本发明粘红酵母菌体易于制备，反应条件温和，产物收率高，易于工业化。
文档编号C12P13/02GK102443547SQ20101050982
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者刘章琴, 吴中柳, 张超, 杨涛, 林晖, 汤传根 申请人:中国科学院成都生物研究所