专利名称：一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株及其建立方法
技术领域：
本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株及其建立方法和用途。
背景技术：
肺癌是临床最常见、恶性程度最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率和死亡率的前3位。在我国尤其是大、中城市，肺癌自二十世纪八十年代起始终是首位恶性肿瘤杀手。目前，肺癌的临床治疗原则还是以外科手术为主的多学科综合治疗。经过几十年的不懈努力，已有相当一部分病人可采取早诊断、早治疗和积极的综合治疗(包括手术、放疗、化疗和生物治疗等)而获得长期生存，但大部分病人就诊时已属晚期，肿瘤广泛转移，其中骨转移者高达40％，肺腺癌骨转移率高达51.6％。这类患者的治疗效果很差，一年生存率不超过20％。目前对于肺癌骨转移缺乏有效的诊疗方法和药物。因此，深入研究人肺腺癌骨转移的分子机理和积极寻找有效的检测、诊疗手段，具有非常重要的意义。由于IIIa期以上的晚期肺癌属于手术禁忌，难以获得实验材料对骨转移癌细胞进行系统研究，因而建立人体肺腺癌的骨转移模型是目前开展此类研究的唯一选择。
有报道，采用肿瘤细胞心室注射乳腺癌和黑色素瘤细胞的方法制备裸鼠骨转移模型，取得较好效果[Wakabayashi，Oncology，2000 Jun；59(1)75-80；Sasaki，Anticancer Res，1998 May-Jun；18(3A)1579-84]。文献[Iguehi，Cancer Res 1996Sep 1；56(17)4040-3]报道了用人肺鳞癌细胞左心室注射形成骨转移模型，研究甲状旁腺素相关蛋白在骨转移中的作用。文献[Miki，Oncol Res 2000；12(5)209-217.]采用静脉注射人小细胞肺癌的方法制备SCID鼠骨转移及其它多脏器转移模型，并用X线检测骨转移情况。也有文献[Kjonniksen，Cancer Res，1992 Mar1；52(5)1347-51；Arguello，Int J Cancer，1991 Jun 19；48(4)583-90]报道进行心室注射制作骨转移模型的一个缺点是会引起脑、肺、肾上腺皮质等多发性转移，并造成实验鼠骨转移尚未出现而因其它脏器转移而死。文献[Nicolson，ExpCell Res，1993 Feb；204(2)171-80]报道，为解决肿瘤细胞引起多脏器转移问题，可将较强骨转移灶形成能力的细胞进行多次骨转移制作，以期分离出新的单纯骨转移的细胞变种。
国内外文献均未见使用放射性同位素骨显像在骨转移动物模型中寻找骨转移灶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株及其建立方法。本发明的进一步目的是提供该肺癌细胞株的医用用途。
本发明采用人肺腺癌SPC-A-1细胞株作为源细胞，通过免疫缺陷小鼠体内、外连续筛选及核素骨显像检测的方法，建立了一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株(Human Lung Adenocarcinoma cell Subpopulation with Highly Bone Metastasis，SPC-A-1BM)。已于2004年9月23日保藏，保藏单位CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号CGMCC No.1226，分类命名人肺腺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM。本细胞株具有以下生物学特性1、细胞体积小，经过in vivo到in vitro几个循环后细胞逐渐变小，在第六代后能在血道一次注射200万骨转移细胞。
而亲代细胞(SPC-A-1低分化肺腺癌细胞)则体积较大，甚至比大细胞肺癌的细胞还大。若首次血道注射细胞量必须小于百万(70-80万/只裸鼠)，否则会引起裸鼠栓塞而死亡。
2，细胞生长迅速。
将亲代细胞和3-4个循环后的骨转移细胞在相同细胞量、相同条件下同时培养，每天观察可发现骨转移细胞生长迅速，培养瓶中除了贴壁细胞外还有许多悬浮细胞，这在亲代细胞中少见。
3，短期滞瘤率高。
从开始皮下注射100-200万癌细胞，肿瘤生长至1公分需1.5-2个月，而且仅70-80％滞瘤；循环3-4代后皮下注射100万骨转移细胞，肿瘤生长至1公分仅需一周时间且100％滞瘤。
4，骨转移率逐代提高。
表1是各代细胞的滞瘤率、注入细胞量及其骨转移率的比较。
5，裸鼠形成骨转移的时间逐代减少。
表2是不同注射方式引起荷瘤裸鼠形成骨转移的天数比较。
6，转移部位出现的比率高。
表3是不同注射方式引起荷瘤裸鼠组织转移比率的比较(％)。
7，细胞株的恶性程度高。
骨转移细胞以人Her-2肿瘤表面抗体标记，经流式细胞仪测定，阳性率为90.9％，超出亲代细胞10个百分点。表明该细胞株是人源细胞且恶性程度高、预后差。
表1.
其中1，皮下滞瘤率系指每只裸鼠皮下注射百万细胞后统计。
2，细胞量系指可注射的最大细胞量。说明多次筛选后细胞逐步变小。
表2.
表3.
本发明通过下述方法建立具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株。
采用实验动物免疫缺陷小鼠(nude mice，SCID mice，NIH-III BNX mice)，通过已建立的人肺腺癌骨转移动物模型，将肺腺癌细胞经实验小鼠血道注射后形成转移，在放射性同位素骨显像剂示踪确定骨转移病灶后，体外培养病变组织获得骨转移性肺癌细胞亚群，重复以上循环最终获得具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞。包括下述步骤1、免疫缺陷小鼠血道注射亲代肺腺癌细胞后，首次注射细胞量70-80万/只裸鼠，形成个别脏器转移；2、小鼠尾静脉注射放射性同位素骨显像剂后，通过单光子发射型计算机断层仪(SPECT)或配置特定针孔准直器的伽马相机行骨显像检出小鼠骨转移病灶；3、体外培养病变骨组织获得骨转移性肺腺癌细胞亚群；4、上述癌细胞重复以上循环获得具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞亚群；5、对上述骨转移细胞进行生物学特性分析，确定具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞包括超微结构比较；细胞群体倍增时间；染色体核型分析；尾静脉、皮下注射部位的致瘤率、转移率和特异性。
本发明上述方法经8次循环，癌细胞动物骨转移率达80％以上。
采用本发明高潜能骨转移肺腺癌细胞株通过人肺腺癌的骨转移动物模型，结果显示骨转移具有快速、特异性高的特点。本发明克服了已有技术“骨显像灵敏度高、特异性低”的缺陷，使得骨转移周期从最初的3个月到目前的21-28天；转移部位从最初的难以形成转移(因冻存的所有肺癌细胞株由于长期反复冻存传代以至活性降低)，或用X线检测即使能检出骨转移灶却也无法复制(X线摄片剂量会将小鼠转移组织的癌细胞杀死)，因此无法获得骨转移细胞，到目前既能检测出骨转移灶又能在体外原代培养出新一代骨转移细胞。本发明在荷瘤免疫缺陷小鼠体内注入一定剂量的放射性同位素使得既能检测出骨转移灶又能将这转移灶在体外原代培养出新一代骨转移细胞，然后再注入小鼠体内，由此在免疫缺陷小鼠体内和体外反复筛选后使得癌细胞活性大增。血道注射3、4代后较多地出现嘴部、头部、肺部、肾上腺、脊柱、四肢骨和肋骨转移，形成典型的肺腺癌转移模式；滞瘤率从开始皮下注射100-200万癌细胞，瘤长到1公分需1.5-2个月而且仅70-80％滞瘤到目前皮下注射100万骨转移细胞，瘤子长到1公分仅需一周时间且100％滞瘤。
本发明建立了以人肺腺癌的骨转移动物模型为主的人肺腺癌转移系列模型和高潜能骨转移肺腺癌细胞株。能对人肺腺癌骨转移进行早期诊断提供参考数据，还可进一步建立相关基因芯片技术，评估探索各种药物包括化学、生物、免疫、中医药、放射性药物等治疗疗效。为系统研究肺癌多发转移和探索诊疗人体肺癌骨转移提供了技术平台。同时，为进一步分析肺癌骨转移相关的功能基因组以及骨转移的相关基因，加深对肺癌骨转移分子机理的认识，为骨转移的早期诊断、评估疗效提供一种有效的分子检测方法。
图1，图2是正常裸鼠上下半身骨显像。图3是SPC-A-1细胞。图4是第4代骨转移细胞。图5是裸鼠颅骨、腰椎肿瘤。图6，腰椎肿瘤病理切片。图7，裸鼠颚骨、左肱骨肿瘤。图8，裸鼠左肱骨肿瘤病理切片。图9，上、下颚骨转移。图10，病理示颚骨转移。图11，右头部肿大。图12，下颚软组织瘤。图13，上颚和左下颚M。图14，颚骨转移病理。图15，双侧上颚肿大。图16，颚下腺瘤M。图17，肋骨转移。图18，病理切片证实。图19，颚下腺肾上腺M。图20，肾上腺M病理。
图21、22是对骨转移细胞经流式细胞仪测定结果，其中，区域A是细胞密度含量散点，测得计数占总计数的百分率，测得区域内的计数，X轴、Y轴均值；区域B是荧光素时间段强度，测得峰值区域内计数占总计数的百分率，测得B区域内计数，X轴、Y轴均值；其中图21，鼠抗体标记骨转移细胞作为对照组，图22是Her-2肿瘤表面抗体标记阳性率为90.9％。
具体实施例方式
实施例1
1，预实验 人肺腺癌细胞(SPC-A-1)1×106，注入免疫缺陷小鼠皮下，待瘤子长到0.5-1公分时取出瘤子，取周边瘤体组织剪碎、捣浆、细胞培养，细胞长出后扩增到所需细胞量备用。
2，免疫缺陷小鼠 体重大于20克，雌雄不论。购进后SPF级笼养数日。
3，麻醉实验动物 在小鼠的腹腔和腿部肌肉分别注入稀释硫喷妥钠及氯胺酮，4，癌细胞注射 首次在麻醉小鼠的左心室注入0.7×106人肺腺癌细胞，SPF级笼养。
5，称重 注射两周后隔天称重。体重低于16克要严密观察防止死亡。
6，显像 每两周分别作同位素骨扫描，发现骨转移灶，选取符合肺癌远端转移特点的骨骼材料作体外培养及病理切片。
免疫缺陷小鼠经左心室注射人肺腺癌细胞后形成转移，通过小鼠尾静脉注射放射性同位素后，在配置孔径直径为1mm的针孔准直器的伽马相机和双探头西门子ECT平面骨显像确定骨转移病灶，结果证实采用放射性同位素骨扫描检测骨转移病灶比X线早3-6个月。上述伽马照相机针孔显像时的麻醉剂量以每只小鼠一次麻醉静卧2小时以上为宜。静脉系统注射癌细胞可不麻醉。
7，骨转移细胞体外传代培养将取出的小鼠疑似骨转移灶，剪成小块放细胞培养瓶培养，待长出癌细胞后进一步扩增，然后将骨转移细胞再注射于小鼠血道。获得骨转移性肺癌细胞亚群，用该癌细胞重复8-10个以上循环最终获得具有骨转移高潜能的肺癌细胞。
检测显示第六代骨转移细胞较源细胞缩小30％，其浸润、迁徙能力是源细胞的3倍，裸鼠移植成瘤率高，皮下移植成瘤率是100％，经血道注射后能引起骨、肺、肾上腺、颚下腺、脑和心肌转移，尤其骨骼转移发现时间早，转移灶数目较多。左心室注射骨转移细胞引起肺、骨、肾或肾上腺、颚下腺和淋巴结等组织转移时间为接种3周时，平均转移灶数目为4。
实施例21，细胞 免疫缺陷小鼠左心室注射癌细胞二次循环后原代培养出的骨转移细胞，备用。
2，免疫缺陷小鼠 体重大于20克，雌雄不论。购进后SPF级笼养数日。
3，尾静脉注射 ，从尾静脉注入≥106癌细胞后，SPF级笼养。
4，称重 注射三周后每周称重，体重低于16克要严密观察防止死亡。
5，显像 一个月后每两周作同位素骨扫描，发现骨转移灶后取出作体外培养。
6，骨转移细胞体外传代培养 重复以上工作直到获得新的骨转移细胞亚群。
结果显示，第四代尾静脉注射肺腺癌骨转移细胞的小鼠36天核素骨显像发现右上颚、左肱骨头、肋骨、脊柱放射性异常浓聚；解剖发现肺、肾上腺和下颚软组织异常；病理证实癌转移。尾静脉注射骨转移细胞引起肺、骨、淋巴结和肾上腺等转移时间为接种4-5周时，平均转移灶数目为3个。
本发明所采用的细胞培养基为10％小牛血清RPMI1640培养基，pH＝7，培养温度为37℃。
权利要求
1.一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株，其特征是所述细胞为人肺腺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM，保藏编号CGMCC No.1226，具有以下生物学特性细胞体积小，较源细胞缩小30％，细胞生长迅速，其浸润、迁徙能力是源细胞的3倍，裸鼠移植成瘤率和短期滞瘤率高，经血道导致多部位转移灶，恶性程度高，人Her-2肿瘤表面抗体标记阳性率为90.9％。
2.根据权利要求1所述的具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株，其特征是所述细胞株经血道导致多部位转移灶包括骨、肺、肾上腺、颚下腺、脑和心肌，其中以骨骼转移早，数目多；左心室注射骨转移细胞引起组织转移时间为接种3周时，平均转移灶数目为4，尾静脉注射骨转移细胞引起转移时间为接种4-5周时，平均转移灶数目为3个。
3.根据权利要求1所述的具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株，其特征是所述短期滞瘤率为一周时间肿瘤生长至1公分，所述肺腺癌细胞株短期滞瘤率为100％滞瘤。
4.按权利要求1所述的具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株，其特征是所述源细胞是SPC-A-1细胞。
5.权利要求1所述的具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株的建立方法，其特征是包括下述步骤1)麻醉免疫缺陷小鼠，血道注射亲代肺腺癌细胞，形成脏器转移；2)小鼠尾静脉注射放射性同位素骨显像剂，通过单光子发射型计算机断层仪或配置特定针孔准直器的伽马相机行骨显像检出骨转移病灶；3)体外培养病变骨组织获得骨转移性肺腺癌细胞亚群；4)重复以上循环获得具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞亚群；5)生物学特性分析上述骨转移细胞，确定具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中步骤1)的麻醉剂量以每只小鼠一次麻醉静卧2小时以上为宜，首次注射细胞量为70-80万/只裸鼠。
7.根据权利要求5的方法，其中所述方法以放射性同位素进行骨显像检测骨转移灶。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域。本发明采用人肺腺癌SPC－A－1细胞株作为源细胞，通过免疫缺陷小鼠体内、外连续筛选及核素骨显像检测的方法，建立了一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株SPC－A－1 BM，具有以下生物学特性细胞体积小，较源细胞缩小30％，细胞生长迅速，其浸润、迁徙能力是源细胞的3倍，裸鼠移植成瘤率和短期滞瘤率高，经血道导致多部位转移灶，恶性程度高，人Her－2肿瘤表面抗体标记阳性率为90.9％。为系统研究肺癌多发转移和探索诊疗人体肺癌骨转移提供了技术平台和有效的分子检测方法。
文档编号C12N5/08GK1712521SQ20041009306
公开日2005年12月28日 申请日期2004年12月15日 优先权日2004年12月15日
发明者扬顺芳 申请人:上海市胸科医院