专利名称：一种羟基烷酸聚合体及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种由在高分子主链上形成羧酸酯键的反应制得的高分子化合物，具体属于一种羟基烷酸聚合体(以下简称PHA)及其生产方法。
背景技术：
PHA是一类由生物合成的结构简单的高分子聚合物，是原核生物主要的碳源与能源贮藏物质。原核生物在不平衡代谢条件下，便会利用剩余的营养物质合成PHA并以颗粒的形式离散地分布在细胞中，其含量最高可达细胞干重的90％，在生长需要时，再将其分解利用。正是由于这一生物学特性，赋予了这类物质生物可再生性与生物可降解性。
研究表明，PHA有着与通用塑料，如聚丙烯，非常相似的理化性质，通过塑性加工可以制作很多产品。正是由于它的这些物理、化学和生物学特性，使其成为一类可以替代传统石化塑料的“环境友好型”的新型生物热塑材料。近年来发现，PHA具有良好的生物相容性、降解产物无毒性及表面可修饰性等性质，这便极大地拓展了它的应用范围，使其在医疗与医学组织工程方面有了广阔的应用前景。它不仅可以制作手术缝合线、创口覆膜及各种医疗器械等，还可以作为克隆器官的支架材料。美国Metabolix公司的WilliamsS.F等人于1998年就以PHA为框架在体外培养出了患者的自体血管。2000年，美国哈佛大学医学院又运用PHA模型成功克隆了心脏瓣膜。近来还发现，分子量在10万左右的纳米级PHA是制作药物缓释剂的理想材料。
世界各国对于PHA的研究主要集中在开发生产菌株、构建基因工程菌、探索代谢途径及调控机理、创建生产方法与技术、测定产品结构与性能和拓宽应用范围等方面，并且已经取得了较大进展。
至今已发现有90多个属的原核生物可以在体内积累PHA(Handbook of BiodegradablePlastic，Research Association of Biodegradable Plastic，NTS Co.，Ltd.，pp.178-197)，然而用于PHA研究与生产的微生物菌种主要集中在产碱菌属、假单胞菌属、根瘤菌属等少数几个属的微生物。此外，通过基因工程手段还构建了多株能够合成PHA的基因工程菌。
大部分原核生物合成的PHA种类为PHB，但也有一些微生物能够合成由其它单体组成的同型或异型PHA。迄今为止，已经发现了100多种不同的羟基烷酸单体。这些单体可以是饱和的或不饱和的羟基烷酸，可以是带有芳香族侧链的羟基烷酸，还可以是带有卤素或氰基取代基的羟基烷酸。羟基的取代位置可以分别在烷酸的2、3、4、5、6位碳原子上，但其中以3-羟基烷酸单体最为普遍。这些不同单体构成的PHA，其物理学性能既有通性，也有特性。许多研究报道证实，PHA的单体碳链越长，其柔韧性就越好。一般来说，短链PHA(ssc-PHA)比中链PHA(msc-PHA)更为坚硬，而msc-PHA比ssc-PHA更为柔韧。在线形PHA链上增加一些特殊侧链取代基常常会赋予PHA新的性质与功能。此外，组成PHA的单体数目的多少，即PHA分子量的大小，也会在一定程度上影响PHA的性质与用途。一般来说，PHA的分子量在50000～1000000Da之间，倘若其分子量低于20000，其热塑性能便会受到很大的影响。
生物合成不同的PHA，与微生物种类、代谢途径、培养基成分、培养条件及调控方式等因素密切相关。据报道，采用真养嗜碱菌H16菌株[Alcaligenes eutropus H16(ATCCNo.17699)]不仅能够生产PHB，而且应用其突变株通过不同碳源可以合成各种比例的3-羟基丁酸(3-HB)和3-羟基戊酸(3-HV)聚合体[P(HBHV)](U.S.Pat.No.4,393,167和4,876,331)。在U.S.Pat.No.5,200,332专利中，建立了一种以甲养菌、副球菌、嗜碱菌和假单胞菌(Methylo-bacterium sp.Paracoccus sp.，Alcaligenes sp.和Pseudomonas sp.)为生产菌株，以乙醇为碳源合成P(HBHV)的方法。
在Appl.Environ.Microbiol，58(2)，746(1992)中报道了食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)可以利用辛酸作为底物合成羟基丁酸(HB)、羟基己酸(HH)、羟基辛酸(HO)和羟基癸酸(HD)聚合体[P(HB-HH-HO-HD)]，其中单体HB、HH、HO、HD的比例为1∶15∶75∶9；而以癸酸为底物时合成P(HB-HH-HO-HD)的HB、HH、HO和HD的单体比例为8∶62∶23∶7。
在U.S.Pat.No.5,292,860和Japanese Patent Application Laid-Open No.7,265,065中由豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)以橄榄油和油酸作为碳源合成了P(HBHH)。张瑾、吴琼、陈国强等人利用嗜水性气单胞菌(Aeromonas hydrophila 4AK4)以豆油为碳源也合成了P(HBHH)(食品与生物技术，Val，21，76-79，2002)。欧阳少平、吴琼、陈国强等人构建了两株嗜水性气单胞菌(Aeromonas hydrophila WQ和Aeromonas hydrophila 4AK4)基因重组菌，以葡萄糖酸钠和月桂酸为碳源合成了P(HBHH)，并进行了6L发酵罐的发酵试验(生物工程学报，Vol，19，709-714，2003)。
综上所述，为了改善PHA的理化性能、加工性能和拓展其应用范围，在生产菌种的开发、改造及其生产方法等方面已经开展了不少研究，并取得一定进展。在与本发明相近似的羟基烷酸聚合体的研究方面，有关成果及其特点如下(1)开发出了由四种羟基烷酸单体组成的聚合体P(HB-HH-HO-HD)，由两种羟基烷酸单体组成的二聚体P(HBHV)和P(HBHH)，但尚未见到P(HBHO)二聚体的开发报道。(2)羟基烷酸聚合体的理化性质，首先与组成聚合体的单体种类有关。比较P(HBHH)和P(HBHV)的性能，前者较后者脆性低而弹性强，具有良好的加工性能。比较P(HBHO)和P(HBHH)，P(HBHO)的弹性和加工性能更优。其次，羟基烷酸聚合体的性质与聚合体的单体比例有关。在P(HB-HH-HO-HD)中单体种类较多，一般来说单体种类越多，在发酵生产中控制各种单体比例就越难，生产单体比例相对固定和理化性能相对稳定的PHA产品就比较困难。(3)在相关的羟基烷酸聚合体研究中，采用的微生物菌株有假单胞菌、气单胞菌及相关的基因重组菌。这些菌株共同的生理学特性是以脂类或脂肪酸作为唯一碳源合成3-羟基烷酸聚合体，其对碳水化合物类碳源的利用能力较差，特别是嗜水性气单胞菌，当葡萄糖浓度达到1％，就会对菌体生长与PHA合成形成抑制作用。然而，对于绝大多数微生物来讲，碳水化合物是其生长的最佳碳源，因此研究以碳水化合物为基质，辅以代谢调控手段合成羟基烷酸聚合体，对于利用微生物开发羟基烷酸聚合体产品更具有代表性。此外，目前在食品与医疗产品的生产过程中一般不采用基因重组菌作为生产菌株，以避免出现生物安全性问题。(4)在与本发明相近似的羟基烷酸聚合体的相关研究中，采用的主要原料分别为橄榄油和油酸、豆油和月桂酸、葡萄酸钠和月桂酸等，均未报道下游提取与加工过程。一般来说，以油类作为碳源发酵生产PHA会增加产品提取的难度，常常会影响PHA的质量。而以葡萄酸钠作为发酵原料，会因其价格较高，加大生产成本，影响其应用范围。
发明内容
本发明旨在以生产性状优良的菌株，利用较廉价的原料，发酵制得一种新型的羟基烷酸聚合体。此产品性能优良且内毒素含量符合要求，能作为医疗、医学组织工程及其他领域的新型热塑生物材料。
本发明提供的一种羟基烷酸聚合体，其特征在于它是3-羟基丁酸和3-羟基辛酸聚合体[P(3-HB-co-3-HO)，以下简称P(HBHO)]。P(HBHO)的生产方法如下菌种本发明采用的菌种为费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii，以下简称S.fredii)，他人保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.AB92049。
S.fredii菌株的细胞形态为杆状(见图3)，0.5～0.9μm×1.2～3.0μm，不产生芽孢，革兰氏阴性，能与豆科植物有效生瘤，共生固氮。
对于S.fredii菌株的研究与应用，以前主要集中在共生固氮方面，其他生理学功能尚未受到重视而被开发利用。经我们研究发现，该菌株具有底物范围宽、生长速率快、生产性状稳定等优良的发酵生产性状，当该菌株生长在葡萄糖等碳水化合物的培养基上时，在细胞生长的同时便合成一些PHA，到稳定期随着氮源物质浓度的降低，会利用培养基中剩余的碳源物质大量积累PHA。因此，该菌株合成PHA的发酵类型属于部分生长关联型。
显然，该菌株的糖代谢是通过EMP途径生成乙酰CoA。其中一部分乙酰CoA进入TCA环产生能量与还原力，而另一部分乙酰CoA则由酮硫解酶催化两分子乙酰辅酶合成乙酰乙酰辅酶，后者在乙酰乙酰辅酶还原酶的作用下形成3-羟基丁酰辅酶，聚合酶将3-羟基丁酰辅酶聚合成PHB。
然而，当培养基中同时存在葡萄糖和脂肪酸盐时，会启动脂肪酸的β-氧化途径。当加入月桂酸盐时，会合成P(3-HB-co-3-HO)；而加入辛酸盐、己酸盐和丁酸盐及乙酸盐时，均只合成PHB。聚合物中的羟基烷酸单体较基质脂肪酸链少一个四碳结构单位。虽然详细的机理尚待深入研究，但该菌株显然是经β-氧化途径，而非经脂肪酸合成途径获得合成羟基烷酸聚合体前体的。在这一点上是有别于假单胞菌等菌株是经脂肪酸合成途径形成羟基烷酸聚合体的代谢方式。正是由于这一代谢特点，可以应用该菌株，通过月桂酸盐底物水平的代谢调控稳定地生产P(HBHO)产品。
培养基以前对S.fredii的研究主要集中在生物固氮方面，因此已有的培养基配方及培养条件均与固氮作用有关。为了开发该菌株合成PHA的功能，将其用作PHA的生产菌株，本发明应用正交试验，分别以菌体生物量与PHA合成量为检测指标，对该菌株的培养基配方和培养条件进行了优化试验。依照方差分析的结果，制定出适宜的培养基配方和培养条件。
培养基的组分及其含量(g/L)碳水化合物，10～40；(NH4)2SO4，1～5；KH2PO4·12H2O，0.61～1.22；K2HPO4，0.39～0.78；CaCl2，0～0.1；豆芽，100～300；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002。其中碳水化合物是葡萄糖、淀粉水解液或废糖蜜，具体加入量以实际含糖量计算。豆芽，要制成豆芽汁，制法取豆芽加3倍重量的水熬煮，过滤，滤液浓缩至1/3。
优选的各级培养基的组分及其含量(g/L)如下(1)斜面培养基葡萄糖，10；(NH4)2SO4，1.0；KH2PO4.12H2O，0.61；K2HPO4，0.39；CaCl2，0.1；豆芽，100；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；琼脂，20；pH7.0～7.2(用于斜面种子培养)。
(2)摇瓶种子培养基葡萄糖，10；(NH4)2SO4，1.5；KH2PO4·12H2O，0.61；K2HPO4，0.39；CaCl2，0.1；豆芽，100；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；pH7.0～7.2(用于摇瓶种子培养)。
(3)发酵种子培养基葡萄糖，30；(NH4)2SO4，3.0；KH2PO4·12H2O，0.61；K2HPO4，0.39；CaCl2，0.1；豆芽，200；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；pH7.0～7.2(用于种子罐种子扩大培养)。
(4)发酵基础培养基碳水化合物(葡萄糖、淀粉水解液或废糖蜜)，30；(NH4)2SO4，3.0；KH2PO4·12H2O，1.22；K2HPO4，0.78；CaCl2，0.1；豆芽，200；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002；pH7.0～7.2(用于分批发酵或补料分批发酵的基础培养基)。
淀粉水解液制备方法取淀粉20g，加水80ml，制成淀粉乳，调节pH6.5，加热糊化后，加入20000U/ml的α-淀粉酶0.05ml，在95℃水浴中液化2h，再加入50000U/g的糖化酶0.02g，调pH至4.5，在60℃水浴条件下水解6h，过滤，将滤液减压浓缩至30ml。用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量0.5g/ml。
废糖蜜来自山西省大同糖厂，经蒽酮法测定还原糖含量为27.5％。
生产步骤本发明中的P(HBHO)的生产过程可分为斜面及摇瓶种子培养、种子罐种子培养、细胞的高密度发酵与月桂酸盐代谢调控和产物P(HBHO)的分离纯化四个操作单元。具体生产方法包括如下步骤(1)斜面及摇瓶种子培养斜面种子培养接种S.fredii保藏种子至斜面培养基上，在28℃～32℃培养箱中培养。经两次转接活化，作为斜面种子，备用。
摇瓶种子培养将摇瓶种子培养基装入300mL的摇瓶中，装量为100mL，以斜面种子接种一级摇瓶，在28℃～32℃，150r/min(偏心距为30mm)摇床条件下培养14h～18h，再以一级摇瓶种子液接种二级摇瓶，接种量为10％。当细胞生长进入对数期中期，细胞浓度约在1.53g干细胞/L～2.85g干细胞/L(OD600为3.0～5.5)之间，作为种子罐种子液备用。
(2)种子罐种子培养采用10L自控发酵罐为种子罐，使用发酵种子培养基，装料系数0.7，接入种子液，接种量8％～10％，温度控制在28℃～32℃，pH值恒定在7.0～7.2，通气量1∶1(v/v·min)，通过调节搅拌速度使溶氧饱和度维持在20％以上，当细胞生长进入对数期中期，细胞浓度约在10.2g干细胞/L～12.2g干细胞/L(即OD600为20～24)之间，作为发酵罐的种子液。
在种子罐种子培养过程中，检测培养液中细胞及主要营养物质的浓度，镜检细胞形态，通过控制培养时间把握种子液的质量。要求种子液的细胞浓度适当，糖、氮、磷等营养成分在初始量的30％以上，细胞形态整齐均一，且PHA颗粒较少，确保种子液既处在对数生长期，又具有较高的细胞浓度。
(3)细胞的高密度发酵与月桂酸盐代谢调控细胞的高密度发酵采用100L自动控制发酵罐，使用发酵基础培养基，装料系数0.7，接种量8％-10％，温度控制在28℃～32℃，pH值恒定在7.0，通气量1∶1(v/v·min)，通过调节搅拌速度使溶氧饱和度维持在10％以上。
在发酵培养过程，每隔4h取样测定细胞浓度、糖浓度、铵离子浓度和磷酸根离子浓度。当细胞生长进入对数期后，根据发酵液中细胞、糖、铵离子和磷酸根离子浓度的变化情况，通过适时补加碳水化合物和硫酸铵等营养物质，同时将温度、pH值、溶氧等控制至最适条件下，促使细胞迅速生长至高密度状态。
月桂酸盐代谢调控当细胞浓度达到27.5g干细胞/L(即OD600为55)以上时，控制发酵液中糖含量保持在初始量的30％以上，同时限制氮含量在初始量的10％～30％之间。采用月桂酸盐二步加入法进行月桂酸盐的代谢调控。第一步，加入3mmol/L～4mmol/L的月桂酸盐作为基础盐，形成一定的胁迫压，启动β-氧化途径。第二步，以一定速度流加月桂酸盐溶液，使体系中月桂酸盐的总加量达到6mmol/L～10.1mmol/L。加入月桂酸盐后控制发酵液中硫酸铵含量在0.5g/L左右，同时补加糖液使其浓度保持在10g/L左右，调节pH值在7.5，促进P(HBHO)合成。调控2～5h，当P(HBHO)在细胞中达到一定含量且HO单体在P(HBHO)中的比例处在预期范围内，即可放罐，采收细胞。
(4)P(HBHO)的分离纯化我们采取溶剂萃取工艺路线进行产物的分离纯化，基本操作单元依次为发酵液的液固分离、湿细胞干燥、细胞与萃取剂混合、萃取液分离、萃取液浓缩、乙醇沉淀、分离与干燥、P(HBHO)产品。
通过正交实验，以P(HBHO)的收率及纯度为检测指标，对萃取剂的种类、用量、萃取温度、萃取时间、萃取方式进行了选择试验，确定了氯仿为最佳萃取剂，并且优化了萃取条件和萃取方式。同时对细胞与萃取液的液固分离进行了离心与过滤、萃取液浓缩倍数、沉淀剂乙醇的加量等操作条件也进行了研究与优化，建立了一整套分离与纯化P(HBHO)的方法，具体操作方法如下在发酵结束后，首先经管式离心机，在离心因素为15700×g的条件下，控制流速，进行连续液固分离，收集湿细胞，再经二次水洗并离心细胞，80℃下烘干，得干细胞。干细胞用氯仿在30℃～60℃下振荡萃取2h～4h，抽滤，收集萃取液，常压浓缩；加入冷乙醇沉淀，得P(HBHO)粗品，再经2～3次氯仿溶解和乙醇沉淀，得P(HBHO)纯品。
检测方法①细胞干重为加快发酵过程中细胞浓度的测定速度，基于培养液中无颗粒性的营养物质，我们采用分光光度法，在600nm波长处测定细胞悬液的吸光值，然后再根据吸光值与细胞干重曲线折算成细胞浓度。
②还原糖测定3，5-二硝基水杨酸法，蒽酮法。
③铵离子测定改良靛酚蓝比色法。
④无机磷的测定钼酸铵比色法。
⑤PHA含量测定称取15mg干细胞或5mg P(HBHO)产品，加入1ml含15％硫酸的甲醇溶液中溶解，再加入1ml氯仿-苯甲酸溶液(苯甲酸作为内标)于100℃水浴保温140min进行酯化反应，然后将反应液冷却后加入1ml无离子水振荡混匀，3500×g离心15min，收集有机相，加入无水Na2SO4脱水后，用气相色谱分析。
⑥PHA结构的测定经氯仿法提取并精制得PHA纯品，应用75MHz-核磁共振仪测定13C NMR图谱，根据图谱结果分析确定PHA结构。
⑦分子量的测定乌氏粘度计法。
⑧内毒素的测定鲎试剂盒法。
优点与效果本发明采用性状优良的费氏中华根瘤菌为生产菌株，应用廉价而来源广泛的生产原料，使用特有的发酵与调控方式，获得了一种新型的PHA产品，经75MHz-核磁共振仪测定和图谱分析，确定其结构为3-羟基丁酸和3-羟基辛酸聚合体[P(3-HB-co-3-HO)](见附图1)。并且创建了从菌种、上游发酵到下游提取的整套P(HBHO)生产新工艺。通过这一工艺生产的P(HBHO)产品，其分子量适中、内毒素含量低，性能优良，用途广泛，尤其可用作为生物医药和医学组织工程的新型纳米级脂质材料。
我们选用S.fredii作为P(HBHO)的生产菌株。该菌株具有底物范围宽、生长速率快、生产性状稳定、不产生色素等优良生产性状，容易实现高密度发酵生产，且经过脂肪酸盐底物水平的调控能够合成羟基烷酸聚合体。S.fredii是革兰氏阴性菌，利于进行P(HBHO)的分离与纯化。此外，该菌种是自然界的固氮菌，即使在生产过程中不慎流入环境中也不存在生物安全性的问题。
在本发明中，我们详细研究了应用S.fredii菌株生产P(HBHO)的培养基配方和培养条件。结果表明，葡萄糖、淀粉水解液、废糖蜜均可作为碳源，硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等均可作为氮源，酵母膏或豆芽汁均可作为其生长因子，因此主要生产原料价格低廉且来源丰富。如采用最廉价的原料进行生产，原料成本可降低1/2～3/4。此外，由于该菌株生长速率快，温度、溶氧等培养条件适中，发酵管理费用较低，这些都有利于降低P(HBHO)的成本。
在本发明中，依据S.fredii菌株的生长动力学参数和部分生长关联型合成P(HBHO)的发酵类型，建立了细胞的高密度发酵和月桂酸盐代谢调控的发酵管理新工艺。在发酵的第一阶段，发酵管理的重点放在满足细胞生长的需要方面，采用补料分批发酵的方式使菌体细胞快速生长到高密度水平，使发酵液中细胞浓度达到27.5g干细胞/L以上。在第二阶段，发酵管理的重点放在调节P(HBHO)产物的合成方面，经二步法加入月桂酸盐进行调控，合成了P(HBHO)羟基烷酸聚合体，其产量达到14.4g/L～22.1g/L之间。
月桂酸盐两步加入法，不仅满足了羟基烷酸聚合体合成的调控需要，而且消除了因一次性加入脂肪酸盐产生过多泡沫的现象，克服了脂肪酸盐浓度过高抑制细胞合成P(HBHO)活性的弊病，提高了脂肪酸盐的利用率，维持了发酵罐的装料系数，确保了较高的发酵生产率。
本发明以萃取工艺路线为基础建立了一套P(HBHO)的分离纯化方法，此方法具有工艺简单，易于操作等优点。通过此法获得的P(HBHO)产品，收率达到95％以上，纯度达到98％以上。此法不会降低产品的分子量和影响P(HBHO)的性质。此外，应用这一分离纯化方法，可降低P(HBHO)产品中内毒素的含量，可将其内毒素的含量控制在4～6EU/g之间，低于美国FDA规定的最低20EU/g的标准。
由本发明获得的P(HBHO)羟基烷酸二聚体产品，为一种新型PHA产品。国内外尚无生产该产品的专利报道，我们生产的P(HBHO)，其分子量在11.2×104Da左右，可作为纳米级脂质材料，可用在医疗与医学组织工程等领域。
本发明中在摇瓶调控实验的基础上，进行了多次100L发酵罐的扩大发酵试验和小型生产规模的分离纯化试验，已取得扩大生产的相关技术参数，可实现工业化生产。
图1，P(3-HB-co-3-HO)的75MHz-13C NMR图谱图2，以葡萄糖为碳源合成的P(3-HB-co-3-HO)的气相色谱图，图3，以淀粉水解液为碳源合成的P(3-HB-co-3-HO)的气相色谱4，以废糖蜜为碳源合成的P(3-HB-co-3-HO)的气相色谱2、3、4中1为甲醇特征峰，2为氯仿特征峰，3为3-HB单体峰，4为内标峰，5为3-HO单体峰。
图5，费氏中华根瘤菌细胞形态图，图中菌体细胞中深色部分为PHA颗粒。
具体实施例方式
以下实施例中培养基的组分含量同说明书，所用的发酵设备为镇江东方生物工程设备技术公司生产的10L、100L自控发酵罐配套设备。
实例1 以葡萄糖为碳源合成P(HBHO)的发酵生产(1)斜面及摇瓶种子培养将保藏的S.fredii菌种接种在斜面培养基上，于30℃的培养箱中活化两次，转接入装有摇瓶种子培养基的摇瓶中再活化两次，待后一级摇瓶培养14h，当菌体细胞浓度达到1.53g干细胞/L(OD600值为3.0)时，细胞生长仍处于对数生长期，作为种子罐的种子液备用。
(2)种子罐种子培养以10L自控罐为种子罐，采用发酵种子培养基，装料系数0.7，接入种子液，接种量为8％，在30℃培养，通过8mol的NaOH溶液调节控制pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度20％以上，经过20h的种子培养，当细胞浓度达到10.2g干细胞/L(即OD600为20)，作为100L发酵罐的种子液。
(3)细胞的高密度发酵及月桂酸盐代谢调控采用100L自动控制发酵罐进行发酵，使用发酵基础培养基，装料系数0.7，接种量8％。在发酵过程中，控制温度在30℃，pH值恒定在7.0，通气量1∶1(v/v·min)，维持溶氧饱和度在10％以上。每隔4h取样测定葡萄糖浓度、铵离子浓度、磷酸根离子浓度和细胞浓度。在发酵过程中通过适时补加葡萄糖和硫酸铵等，使其在发酵液中的浓度分别维持在10g/L和1g/L以上，满足菌体的生长需求，延长其对数生长期。当细胞浓度达到40.8g干细胞/L(即OD600为80)时，采用月桂酸盐二步加入法进行月桂酸盐代谢调控。第一步，加入一定量0.2mol/L月桂酸盐溶液作为基础盐，使其加量达到3mmol/L，形成胁迫压，启动β-氧化途径。第二步，以一定速度流加月桂酸盐溶液，使体系中月桂酸盐的总加量达到8mmol/L。加盐后维持发酵液中硫酸铵含量在0.5g/L左右，同时补足葡萄糖并保持其浓度在10g/L左右，保持pH值在7.5，促进P(HBHO)的积累，继续培养3h后，放罐。
(4)P(HBHO)的分离纯化采用管式离心机，在离心因素为15700×g的条件下，控制流速，进行连续液固分离，收集湿细胞，水洗并离心两次，在80℃烘干。干细胞加入10倍体积(v/w)萃取剂氯仿，充分混匀，在50℃下搅拌4h，抽滤，收集萃取液。将萃取液在78℃水浴下，蒸馏浓缩至原体积的1/5，得浓缩萃取液，并回收氯仿，然后将浓缩萃取液加入5倍体积的冷乙醇，并缓慢搅拌沉淀，过滤，弃滤液，收集P(HBHO)沉淀，得P(HBHO)粗品，再经2～3次氯仿溶解和乙醇沉淀，室温下干燥得P(HBHO)纯品。
(5)通过GC气相色谱测定干细胞中P(HBHO)含量及产品纯度，P(HBHO)含量为18g/L，(其中HB占79.8％，HO占20.2％，见图2)。
(6)粘度法测定产品分子量，分子量为11.2×104Da。
(7)鲎试剂盒法测定产品P(HBHO)内毒素含量，内毒素含量4.0EU/g。
实施例2 以淀粉水解液作为碳源合成P(HBHO)的发酵生产(1)斜面及摇瓶种子培养将保藏的Sfredii菌种接种在斜面培养基上，于28℃的培养箱中活化两次，转接入装有摇瓶种子培养基的摇瓶中再活化两次，待后一级摇瓶培养16h，当菌体细胞浓度达到2.3g干细胞/L(OD600值为4.5)时，细胞生长仍处于对数生长期，作为种子罐的种子液备用。
(2)种子罐种子培养以10L自控罐为种子罐，采用发酵种子培养基，装料系数0.7，接入种子液，接种量为8％，在28℃培养，通过8mol的NaOH溶液调节控制pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度20％以上，经过21h的种子培养，当细胞浓度达到11.3g干细胞/L(即OD600为22)，作为100L发酵罐的种子液。
(3)细胞的高密度发酵及月桂酸盐代谢调控采用100L自动控制发酵罐进行发酵，使用发酵基础培养基，装料系数0.7，接种量10％。在发酵过程中，控制温度在28℃，pH值恒定在7.0，通气量1∶1(v/v·min)，维持溶氧饱和度在10％以上。每隔4h取样测定糖浓度、铵离子浓度、磷酸根离子浓度和细胞浓度。在发酵过程中通过适时补加淀粉水解浓缩液和硫酸铵等，使发酵液中糖浓度和硫酸铵浓度维持在10g/L和1g/L以上，满足菌体的生长需求，延长其对数生长期。当细胞浓度达到43.7g干细胞/L(即OD600为86)时，采用月桂酸盐二步加入法进行月桂酸盐代谢调控。第一步，加入一定量0.2mol/L月桂酸盐溶液作为基础盐，使其浓度达到4mmol/L，形成胁迫压，启动β-氧化途径。第二步，以一定速度流加月桂酸盐溶液，使体系中月桂酸盐的总加量达到10.1mmol/L。加盐后维持发酵液中硫酸铵含量在0.5g/L左右，同时补加淀粉水解浓缩液，保持糖浓度在10g/L左右，保持pH值在7.5，促进P(HBHO)的积累，继续培养3h后放罐。
(4)P(HBHO)的分离纯化得到的干细胞加入12倍体积(v/w)萃取剂氯仿，在60℃下搅拌2h，其他步骤同实施例1。
本实施例中所得到的P(HBHO)含量为22.1g/L，(其中HB占65.1％，HO占34.9％，见图3)，分子量为18.5×104Da，内毒素含量5.0EU/g。
实施例3、以废糖蜜作为碳源合成P(HBHO)的发酵生产(1)斜面及摇瓶种子培养将保藏的S.fredii菌种接种在斜面培养基上，于32℃的培养箱中活化两次，转接入装有摇瓶种子培养基的摇瓶中再活化两次，待后一级摇瓶培养18h，当菌体细胞浓度达到2.85g干细胞/L(OD600值为5.5)时，细胞生长仍处于对数生长期，作为种子罐的种子液备用。
(2)种子罐种子培养以10L自控罐为种子罐，采用发酵种子培养基，装料系数0.7，接入种子液，接种量为10％，在32℃培养，通过8mol的NaOH溶液调节控制pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度20％以上，经过22h的种子培养，当细胞浓度达到12g干细胞/L(即OD600为24)，作为100L发酵罐的种子液。
(3)细胞的高密度发酵及月桂酸盐代谢调控采用100L自动控制发酵罐进行发酵，使用发酵基础培养基，装料系数0.7，接种量8％。在发酵过程中，控制温度在32℃，pH值恒定在7.0，通气量1∶1(v/v·min)，维持溶氧饱和度在10％以上。每隔4h取样测定糖浓度、铵离子浓度、磷酸根离子浓度和细胞浓度。在发酵过程中通过适时补加废糖蜜和硫酸铵等，使发酵液中糖浓度和硫酸铵浓度维持在10g/L和1g/L以上，满足菌体的生长需求，延长其对数生长期。当细胞浓度达到27.5g干细胞/L(即OD600为55)时，采用月桂酸盐二步加入法进行月桂酸盐代谢调控。第一步，加入一定量0.2mol/L月桂酸盐溶液作为基础盐，使其浓度达到3mmol/L，形成胁迫压，启动β-氧化途径。第二步，以一定速度流加月桂酸盐溶液，使体系中月桂酸盐的总加量达到6mmol/L。加盐后维持发酵液中硫酸铵含量在0.5g/L左右，同时补加废糖蜜，保持糖浓度在10g/L左右，保持pH值在7.5，促进P(HBHO)的积累，继续培养3h后放罐。
(4)P(HBHO)的分离纯化得到的干细胞加入8倍体积(v/w)萃取剂氯仿，在30℃下搅拌4h，其他步骤同于实施例1。
本实例所得到的P(HBHO)含量为14.4g/L，(其中HB占71.4％，HO占28.6％，见图4)，分子量为18.3×104Da，内毒素含量为6EU/g。
权利要求
1.一种羟基烷酸聚合体，其特征在于它是3-羟基丁酸和3-羟基辛酸聚合体[P(3-HB-co-3-HO)]。
2.根据权利要求1所述的羟基烷酸聚合体的生产方法，其特征在于生产中采用的菌种为费氏中华根瘤菌，保藏号为CCTCC No.AB92049。
3.根据权利要求2所述的羟基烷酸聚合体的生产方法，其特征在于生产方法包括如下步骤(1)斜面及摇瓶种子的培养将菌种在培养基上活化，控制温度28℃～32℃，当菌体细胞生长至对数期的中期时，作为种子罐的种子液；(2)种子罐种子的培养将上述种子液接入种子罐中，培养基装料系数0.7，接种量为8％～10％，控制温度28℃～32℃，pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度20％以上，当菌体细胞生长至对数期的中期时，作为发酵罐种子液；(3)细胞的高密度发酵及月桂酸盐代谢调控将发酵罐种子液接入发酵罐中，培养基装料系数0.7，接种量为8％～10％，培养温度28℃～32℃，控制pH7.0，保持溶氧饱和度10％以上，进行补料分批发酵；当菌体浓度达到28.1g干细胞/L以上时，先加入3mmol/L～4mmol/L的月桂酸盐作为基础盐，然后流加月桂酸盐溶液，使发酵液中月桂酸盐的总加量达到6mmol/L～10.1mmol/L，此时进行限氮补糖培养，调节pH7.5，调控2～5h，放罐；(4)产品的分离纯化固液分离，收集湿细胞，烘干；干细胞用氯仿在30℃～60℃下振荡萃取2h～4h，抽滤，收集萃取液，常压浓缩；加入冷乙醇沉淀，得粗品，再经2～3次氯仿溶解和乙醇沉淀，得纯品。
4.根据权利要求3所述的羟基烷酸聚合体的生产方法，其特征在于所述的培养基的组分及其含量(g/L)碳水化合物，10～40；(NH4)2SO4，1～5；KH2PO4.12H2O，0.61～1.22；K2HPO4，0.39～0.78；CaCl2，0～0.1；豆芽，100～300；H3BO3，0.002；Na2MoO4，0.002。
5.根据权利要求4所述的羟基烷酸聚合体的生产方法，其特征在于所述的碳水化合物是葡萄糖、淀粉水解液或废糖蜜。
全文摘要
本发明公开了一种羟基烷酸聚合体，即3－羟基丁酸和3－羟基辛酸聚合体[P(3－HB－co－3－HO)，以下简称P(HBHO)]。其生产方法是选用费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)作为生产菌株，以碳水化合物为碳源，以铵盐为氮源，在最适培养基与培养条件下，通过高密度发酵和月桂酸盐代谢调控，获得P(HBHO)产品。并建立了P(HBHO)的发酵管理方法、分离纯化方法及质量检测方法。通过这一方法生产的P(HBHO)的产量达到14.4g/L～22.1g/L，其分子量控制在11.2×10
文档编号C12N1/20GK1648149SQ20041009243
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者赵良启, 冯涛, 肖婧凡, 王海宾 申请人:山西大学