专利名称：一种新的产黄青霉菌株以及利用此菌株发酵制备青霉素的制作方法
技术领域：
本发明涉及青霉素生产领域，特别涉及一种新的产黄青霉菌及此菌在生产青霉素中的应用。
背景技术：
β-内酰胺类抗生素是目前已知的抗生素中毒性最低，品种最多，临床应用最广的一类抗生素。其中最重要的为青霉素和头孢菌素C，以它们为原料经过化学或酶反应得到中间体，可得到一系列半合成青霉素和半合成头孢菌素，这些中间体主要包括6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酰头孢烷酸(7-ADCA)和氯甲基头孢苄酯(GCLE)、7-氨基头孢烯酸(7-ACA)。6-APA、7-ADCA、GCLE都由青霉素制得，7-ACA由头孢菌素C制得。这些中间体的获得使得半合成抗生素，特别是半合成头孢菌素的品种不断增加。目前，全世界临床应用的半合成青霉素和半合成头孢菌素品种已经超过了120种，占世界抗感染药物市场65％以上。
在工业生产中，青霉素和头孢菌素C分别由产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)和产黄顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)产生，目前，它们的生物合成途径已经清楚由三个前体氨基酸(α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬氨酸)开始，经过缩合，环化反应后形成异青霉素N，这一过程在两种微生物中是一致的，然后由此分叉，再经一系列反应，最终分别得到青霉素和头孢菌素C。与青霉素和头孢菌素C生物合成相关的关键基因都已克隆(Ingolia & Queener，Med.Res.Rev.9245-264，1989；Aharonowitz，et al.，Ann.Rev.Microbiol.46461-495，1992；Ullán，et al.，J.Biol.Chem.27746216-46225，2002)。商业竞争需要青霉素生产企业不断提高青霉素生产菌种的发酵单位，优化发酵工艺，降低动力消耗，以有效降低青霉素的生产成本。几十年来，基于随机突变和分离筛选的育种方法，在产黄青霉生产菌种的改良上取得了显著的成绩(Brakhage，Microbol.Mol.Biol.Rev.62547-585，1998)。随着产量的提高，诱变的积累，应用传统方法进一步提高生产水平已受到限制。在青霉素的工业生产中，菌体生长和青霉素的形成都需要氧气，因此青霉素发酵是个高耗氧过程，随着青霉素菌种生产能力的不断提高，对氧的需求也越来越高，氧气的供应常成为青霉素发酵的限制因素。传统的抗生素工业通常只能通过改变搅拌装置的形状、提高搅拌速率、通入富氧的加压空气来提高发酵液的溶氧水平，虽然有一定的效果，但常受到设备的限制，而且动力消耗巨大。目前仅发酵动力消耗一项即已占青霉素发酵成本的三分之一(郭宏秋、杨胜利，微生物学通报，23227-230，1996)。
透明颤菌(Vitreoscilla)是专性好氧的革兰氏阴性菌，但能在贫氧环境中生长。美国学者研究发现在该菌中存在一种血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin VHb)(Tyree & Webster，J.Biol.Chem.，2536988-6991，1978)，编码该蛋白的基因受环境中氧浓度调控。在高氧环境下，VHb基因不表达；而在低氧环境下，VHb基因表达，细胞质中血红蛋白含量大量增加，由VHb促进氧扩散进入细胞内，并提高氧的利用效率，由此促进菌体生长(Wakabayashi，Nature，332481-483，1986；Khosla，Bio/Technology，8849-853，1990；焦瑞身，生物工程学报，19381-386)。
自VHb发现以来，已经在多种异源宿主中进行了表达和应用研究。在抗生素生产菌育种方面，也取得了一些有益的结果。Brünker等以PmerR启动子驱动vhb基因在红霉素工业生产菌，红霉素糖多孢菌中有效表达，可使该菌的红霉素生产能力在摇瓶发酵水平提高60％(Brünker，et al.，Microbiology，1442441-2448，1998)。Minas等在10-15L的发酵罐中试验，可将红霉素工业生产菌株产量提高70％，而且单位菌体产红霉素能力提高幅度更是高达2.3倍(Minas et al.，Biotechnol Prog，14561-566，1998)。DeModena等将以PTR-1启动子驱动的vhb基因在头孢菌素C工业生产菌，产黄顶头孢中有效表达，可使该菌的头孢菌素C生产能力在摇瓶发酵水平提高50％以上，最高的提高幅度能达到3.2倍，即4g/l的生产水平(DeModena，et al.，Bio/Technology，11926-929，1993)。DeModena等同时也将PTR-1启动子驱动的vhb基因在青霉素工业生产菌，产黄青霉菌中有效表达，但没有提高产量的报道。孙传保等将vhb基因转入青霉素工业生产菌株，产黄青霉P-9时，共获得了53株转化子，但只有一株有产青霉素能力，不仅没有提高生产菌株的青霉素生产能力，而且必须在含有高浓度KCl的培养基中才能生长，给后续的工作带来了很多的麻烦。(孙传宝等，中国医药工业杂志，3364-67，2002)因此，如何将vhb基因成功转入青霉素工业生产菌株并使其可控表达，有效地提高工业生产菌株的青霉素生产能力，降低青霉素生产过程对低氧的耐受性，从而低价、高效地生产青霉素一直是本领域技术人员着力解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种生产青霉素的产黄青霉菌；本发明所提供的生产青霉素的产黄青霉菌是产黄青霉NCPC 4336该菌株已经于2004年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号CGMCC No.1248。
本发明的第二个目的是提供生产青霉素的产黄青霉菌的选育方法，包括1.在产黄青霉菌表达信号序列的转录和翻译调控下，用透明颤菌氧结合蛋白基因转化产黄青霉菌；2.在培养基中发酵所述的菌株可以提高青霉素的产量。
本发明利用vhb基因成功构建了一种产黄青霉菌有效的基因工程重组质粒，将vhb基因受产黄青霉菌中青霉素生物合成的关键酶，异青霉素N合成酶(IPNS)基因的启动子Pipns和构巢曲霉色氨酸生物合成基因trpC的终止子TtrpC的调控，转化产黄青霉菌后可有效表达vhb基因，增加单位发酵液中的菌体量，并有效提高青霉素的产量。
本发明公开了转化产黄青霉菌的高效的透明颤菌氧结合蛋白基因(vhb)的重组质粒。通过转化青霉素工业生产菌株，在产黄青霉菌中有效可控表达透明颤菌vhb基因，利用透明颤菌氧结合蛋白的特性筛选青霉素高产的工业生产菌种，使得产黄青霉菌细胞中可利用的氧增加，提高细胞能量生成的效率，增加细胞生成和青霉素合成，从而提高最终产量。通过本方法得到的青霉素高产菌种生长快，菌体量大，青霉素生产能力强。由此有效提高青霉素的工业生产水平。
利用透明颤菌氧结合蛋白基因重组得到的产黄青霉基因工程菌在固体培养基上菌落直径为1.1厘米至1.4厘米；菌落呈圆馒头状，中间凹陷；菌落颜色为淡黄绿色，放射线少。在液体培养条件下菌丝变细长。
图1为质粒pPIPKA的物理图谱
具体实施例方式
以下实施例仅用于说明本发明，不应理解为对本发明的限制。除非特别说明，本发明实施例中所用的百分比为重量体积百分比。
实施例1基因克隆和基因转化载体的构建产黄青霉的转化载体pPIPKA按照申请号为200410012139.4的中国发明专利描述构建而成。pDH25的质粒载体购自美国真菌遗传库(FungalGenetics Stock Center，University of Kansas Medical Center)。基因转化用宿主菌产黄青霉菌ATCC 28953购自美国典型培养物保藏中心。pGEM-T为美国Promega公司的产品。
本发明中所用的分子克隆技术，包括DNA的分离纯化、DNA合成、聚合酶链式反应(PCR)、DNA的限制性内切酶酶切，DNA的连接、大肠杆菌转化筛选、序列分析等都是本领域中非常熟悉的，在Sambrook等著的Molecular Cloning，a laboratory manual一书中有充分地描述。
根据文选中公开的透明颤菌氧结合蛋白基因(vhb)序列(Khosla&Bailey，Mol.Gen.Genet.214158-161，1988)我们进行了基因序列设计并进行了基因全合成。合成的含有453个碱基对的vhb基因序列见序列表中序列NO1。
在合成的vhb基因序列中，其5’端引入了Nco I内切酶位点，3’端引入了Bam HI内切酶位点。
为了克隆构巢曲霉色氨酸合成酶C的基因的终止子TtrpC，根据文选(Punt，et al.，Gene 56117-124，1987)报道的序列设计合成一对引物ptrl5’-ggatccacttaacgttactga--3’见序列表NO2、prt25’-aagcttcgagtggagatgtggagtg-3’见序列表NO3。以pDH25的质粒DNA为模板，克隆769bp的TtrpC序列，两端分别引入BamH I和Hind III酶切位点，连接到pGEM-T载体上，得到质粒pGEMT/TtrpC。双脱氧核苷酸测序法测序结果表明，该序列和文献报道基本一致(Punt，et al.，Gene 56117-124，1987)。
在pPIPKA质粒的基础上，为了将vhb基因转入产黄青霉中并得以表达，我们将克隆的vhb(包括ORF及其本身的终止序列)连上ipns的启动子(pIPNS)和trpC的终止子TtrpC，将此表达盒(pIVT)克隆于pPIPKA的BamHI/HindIII位点，定名为pBIVT，其物理图谱如图1所示。
实施例2产黄青霉转化与阳性克隆筛选1.微生物的培养产黄青霉菌NCPC10086生长在YPD培养基中(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。该菌的染色体DNA用于分离Pipns序列。同时该菌也用作cefE基因转化宿主。用于制备原生质体的菌体培养也用YPD培养基。
2.产黄青霉菌的转化采用Ca-PEG介导的原生质体转化法，按王富强等的方法(菌物学报，2366-72，2004)，将pBIVT载体转化产黄青霉。阳性克隆在含有博来霉素的YPD选择性培养基筛选。
3.转化子检测通过在选择性培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2ug/ml博来霉素)上传代培养两次来纯化产黄青霉转化子。单一的稳定菌落用于制备孢子并筛选含有vhb表达盒的转化子。博来霉素抗性菌落的菌体以Novozyme234消化，苯酚抽提后作为PCR模板筛选含有vhb表达盒的转化子。Vhb扩增用引物序列为pxv15’-ATC gAT ATg TTA gAC CAg CAA-3’见序列表序列NO4，pxv25’-ggA TCC TTA TTC AAC CgC TTg-3’见序列表序列NO5。Vhb基因阳性的菌株进行发酵(实施例2)，发酵产物HPLC分析评价vhb基因阳性转化子青霉素生产能力的高低。
实施例3摇瓶发酵与目的产物检测产黄青霉ATCC 28953用实施例1中所述的转基因载体pBIVT进行转化，得到阳性克隆272个。转基因阳性菌株以2×106分生孢子/ml接种种子培养基(g/l)葡萄糖，30；乳糖，10；绵子饼粉，10；酵母粉，10；玉米浆，10；(NH4)2SO4，2；KH2PO4，1；CaCO3，5。pH 5.8。26℃，48小时。种子培养物以5％接种量接种发酵培养基(g/l)乳糖，120；绵子饼粉，30；玉米浆，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH 6.5，26℃，144小时培养。
发酵结束后，离心发酵液以8000g离心力离心15分钟除去菌丝体，得到发酵上清液用于青霉素产量检测。检测按照标准方法(Brownlee et al.，J Gen Microbiol，1949)进行。通过272株菌的试验结果，与出发菌株相比，转基因菌株的青霉素产量明显提高，提高幅度超过了26.1％。
序列表NO1<110>华北制药集团有限责任公司<120>一种新的产黄青霉菌株以及利用此菌株发酵制备青霉素<130>refered<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>453<212>DNA<213>Penicillium chrysogenum<400>1ccatggatgt tagaccagca aaccattaac atcatcaaag ccactgttcc tgtattgaag60gagcatggcg ttaccattac cacgactttt tataaaaact tgtttgccaa acaccctgaa120gtacgtcctt tgtttgatat gggtcgccaa gaatctttgg agcagcctaa ggctttggcg180atgacggtat tggcggcagc gcaaaacatt gaaaatttgc cagctatttt gcctgcggtc240aaaaaaattg cagtcaaaca ttgtcaagca ggcgtggcag cagcgcatta tccgattgtc300ggtcaagaat tgttgggtgc gattaaagaa gtattgggcg atgccgcaac cgatgacatt360ttggacgcgt ggggcaaggc ttatggcgtg attgcagatg tgtttattca agtggaagca420gatttgtacg ctcaagcggt tgaataagga tcc 453
NO2<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2ggatccacttaacgttactga21NO3<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3aagcttcgagtggagatgtggagtg25NO4<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4atcgatatgttagaccagcaa21
NO5<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5ggatccttattcaaccgcttg2权利要求
1.产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CGMCC No.1248。
2.一种表达透明颤菌氧结合蛋白基因的产黄青霉转基因载体pBIVT。
3.权利要求2所述的载体，其中驱动透明颤菌氧结合蛋白基因的启动子序列为Pipns。
4.权利要求2所述的载体，其中控制透明颤菌氧结合蛋白基因的终止子序列为cyclTT。
全文摘要
本发明公开了一种产黄青霉菌株及其在生产青霉素的应用。本发明所提供的菌株是产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CGMCC No1248。本发明公开的菌株培养条件简单，表达量高。本发明公开了利用上述菌株生产青霉素方法。
文档编号C12N15/80GK1796537SQ200410092430
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月23日 优先权日2004年12月23日
发明者徐平, 任志红, 王富强, 丰玫玫, 张佳, 戴梦, 韦春玲, 穆岷, 贾茜, 贺建功 申请人:华北制药集团有限责任公司