含有ADCY8基因用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒及其应用

含有adcy8基因用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒及其应用
技术领域
1.发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及含有adcy8基因用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒及其应用的技术领域。


背景技术：

2.驴奶富含功能性乳清蛋白与不饱和脂肪酸。具有延寿，增强抵强力和免疫力，保肝护胃，美白肌肤等独特功能作用。驴乳所有功效皆为天然的。驴奶是最接近人乳的奶中珍品，对人体的心、胃、脾、肺、肝、前列腺等多种器官有保健作用，其营养成分比例接近人乳的99％。近年来随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，国民饮食结构发生了很大的变化，在营养保健方面的要求也越来越高。在乳制品领域，人们不只满足于牛、羊奶，对奶的功能性有了更多的要求，因此，人们对营养丰富的驴奶需求也越来越大，驴产业有着不可限量的市场前景。
3.据悉，驴只有在哺乳期才产奶，每天能采一斤左右，母驴采奶的黄金期是三个月，一头驴能采六七年。生产1公斤驴奶粉需要12-15公斤鲜驴奶，并且每头驴每天只产1-2公斤鲜驴奶，一头可产奶的驴一年可产250-350千克奶，其中只有100干克的奶可用干加工销售，其余的奶用干喂养小驴，而产出的鲜驴奶，几乎全部被用于加工成驴奶和驴奶粉，所以可以说产销率达到100％。而且随着农业机械化程度的提高，现在毛驴的存栏量以每年30％的速度在减少，驴奶已经成为了资源稀缺性滋补品。
4.中国是世界上养驴最多的国家之一，驴种资源丰富，有近30个驴品种。近年来随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，国民饮食结构发生了很大的变化，人们不只满足于吃牛、羊、猪、鸡等肉食品，对传统的驴肉及其副产品也特别感兴趣。驴的用途正在由役用向肉用、药用、乳用等多用途转变。
5.我国驴奶产业目前处在产业化发展的初期，产业基础较为薄弱。受区域市场因素影响，东西部地区驴奶价格差异较大。
6.但是，目前未有乳用驴的专门化品种，且生产用母驴的个体乳产量较低，远低于牛奶产量，甚至低于驴奶产量，无法满足人们对驴奶的乳制品的需要。新疆驴是一种具有肉、皮、药、乳、役等多种经济用途的畜种。选育具有高产奶性能的乳用驴既可弥补驴奶的市场空缺，又可显著提升新疆驴的饲用价值及经济价值，是促进驴产业发展的重要工作。


技术实现要素：

7.针对现有技术中未见报道对于新疆驴泌乳性状选育有效的分子标记以及未见专门针对adcy8基因在新疆驴泌乳性状筛选中的snp标记研究的技术现状，本发明旨在提供了含adcy8基因用于提高新疆驴泌乳性状的检测试剂盒，利用新疆驴血液样本作为测试材料，利用本发明检测试剂盒通过检测，用于选育提高新疆驴泌乳性状为提高驴产奶量的选育中，期望选择与产奶性状密切相关的dna标记，从而加快育种进程。
8.本发明提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测
adcy8基因的snp位点为g.48366302。
9.本发明提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒，所述试剂盒中adcy8基因的snp位点g.48366302等位基型因包括cc、ct和tt。
10.本发明提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒，所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：
11.(1)根据新疆驴adcy8基因的snp位点g.48366302，自行人工设计特异性引物；
12.(2)pcr反应试剂：2
×
kasp mix、上下游引物、dna模板和水。
13.所述的特异性引物序列如下所示：
14.上游引物1：5'-gaaggtcggagtcaacggattttccaaactttatcacttctactttgt-3'；
15.上游引物2：5'-gaaggtgaccaagttcatgcttccaaactttatcacttctactttgc-3'；
16.下游引物1：5'-agtcaacatcattctcaagttctagc-3'。
17.本发明还提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒的应用，所述试剂盒的应用中，通过检测方法体现，具体包括如下步骤：
18.(1)利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集新疆驴颈静脉血5ml，-20℃保存；提取基因组dna，-20℃保存待用；
19.(2)采用步骤(1)总共提取获得的新疆驴基因组dna进行，adcy8基因pcr扩增，根据设计的引物，利用权利要求1或2任意一项提供的试剂盒特异性扩增adcy8基因；pcr反应体系为，2
×
kasp mix 5μl，100μm上游引物10.015μl，100μm上游引物20.015μl，100μm下游引物0.04μl上下游引物各0.07μl，基因组dna 2μl，ddh2o补充至10μl；反应条件为，94℃起始步骤，1个循环10min；94℃10个循环20s；61℃45s；94℃35个循环20s；55℃20s；
20.(3)基于步骤(2)中扩增获得的产物进行kasp分型：基于引物末端碱基的特异匹配来对snp分型，利用douglas平台，对snp进行双等位基因判断，从而进行基因分型。
21.进一步的，本技术还提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒在产奶量高的新疆驴的选育中的应用。
22.更进一步的，本技术还提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒在乳脂率和蛋白率相对较高的新疆驴的选育中的应用。
23.本发明中，新疆驴的adcy8基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站ncbi(national center for biotechnology)，检索得到驴的adcy8基因的dna序列(genbank id:106824833)，自行人工设计特异性引物。
24.通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：
25.(1)本发明通过提供用于选育新疆驴泌乳性状的试剂盒，利用试剂盒对新疆驴的adcy8基因的snp位点g.48366302进行检测，基于adcy8基因的snp位点g.48366302与新疆驴泌乳后期的日产奶量(kg/d)密切相关，筛选tt型在整个泌乳期产奶量显著高于cc(p＜0.01)。在实际生产应用中，可通过选择tt基因型和ct基因型个体，淘汰基因型为cc的个体，选育提高新疆驴的产奶量，用于专门化乳用驴品种的培育，对于保护新疆驴的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快乳用驴发展具有实际应用价值。
26.(2)本发明中，虽然如上所述，在构建一种用于选育新疆驴泌乳性状的检测试剂盒，在新疆新疆驴群体中，adcy8基因snp位点与新疆驴的产奶量相关，存在3种基因型：cc、ct、tt，c为优势等位基因，此位点突变使新疆驴产奶量上升，为选育泌乳性状优良的新疆驴
品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。
27.(3)本发明通过提供用于选育新疆驴泌乳性状的试剂盒，利用试剂盒对新疆驴的adcy8基因的snp位点g.48366302进行检测，adcy8基因的g.48366302位点与新疆驴乳品质密切相关，ct型显著提高了乳脂率和蛋白率。在实际生产应用中，可通过选择ct基因型个体，选育提高新疆驴的乳品质，用于专门化乳用驴品种的培育，对于保护新疆驴的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快乳用驴发展具有实际应用价值。
附图说明
28.图1所示为检测adcy8基因的snp位点分型结果图。
具体实施方式
29.下面结合具体实施例详细说明本发明，但本发明并不限于下述的实施例。
30.下列实施案列中若无特殊说明，所用技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。
31.下列实施例中若无特殊说明，所用的材料及试剂等均可从商业途径购买。
32.实施例一：用于选育新疆驴泌乳性状的试剂盒
33.本发明提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测adcy8基因的snp位点为g.48366302。
34.本发明提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒，所述试剂盒中adcy8基因的snp位点g.48366302等位基型因包括cc、ct和tt。
35.本发明提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒，所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：
36.(1)根据新疆驴adcy8基因的snp位点g.48366302，自行人工设计特异性引物；
37.(2)pcr反应试剂：2
×
kasp mix、上下游引物、dna模板和水。
38.所述的特异性引物序列如下所示：
39.上游引物1：5'-gaaggtcggagtcaacggattttccaaactttatcacttctactttgt-3'；
40.上游引物2:5'-gaaggtgaccaagttcatgcttccaaactttatcacttctactttgc-3'；
41.下游引物1:5'-agtcaacatcattctcaagttctagc-3'。
42.本发明还提供用于筛选新疆驴泌乳性状的试剂盒的应用，所述试剂盒的应用中，通过检测方法体现，具体包括如下步骤：
43.(1)利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集新疆驴颈静脉血5ml，-20℃保存；提取基因组dna，-20℃保存待用；
44.(2)采用步骤(1)总共提取获得的新疆驴基因组dna进行，adcy8基因pcr扩增，根据设计的引物，利用权利要求1或2任意一项提供的试剂盒特异性扩增adcy8基因；pcr反应体系为，2
×
kasp mix 5μl，100μm上游引物10.015μl，100μm上游引物20.015μl，100μm下游引物0.04μl上下游引物各0.07μl，基因组dna2μl，ddh2o补充至10μl；反应条件为，94℃起始步骤，1个循环10min；94℃10个循环20s；61℃45s；94℃35个循环20s；55℃20s；
45.(3)基于步骤(2)中扩增获得的产物进行kasp分型：基于引物末端碱基的特异匹配来对snp分型，利用douglas平台，对snp进行双等位基因判断，从而进行基因分型。
46.实施例二：用于选育新疆驴泌乳性状的试剂盒应用
47.1、试验方法：
48.(1)试验材料的获取
49.本试验于2021年3月7日至2021年12月4日，在新疆喀什地区岳普湖县驴场进行数据采集工作，试验挑选89头3-5胎次、产驹一个月后、正常泌乳的新疆驴作为研究对象进行本试验的数据采集工作。本次试验所有健康母驴均处于同一饲喂水平下，试验驴群体分布在不同圈舍集中饲养，自由采食采水；工作人员每天固定时间清理水槽、食槽，定期对驴圈进行消杀工作，保持圈舍卫生。日粮组成成分为玉米秸秆、浓缩料、豆粕、麸皮、玉米等。每日早八点、晚八点(根据季节变化提前或推后挤奶时间，前后不超过一小时)由挤奶工依次挤奶，挤奶结束将母驴和驴驹混圈两小时供驴驹自由采食，采食完毕将驴驹分圈饲养。
50.本试验采用萨伊金公式来计算新疆驴泌乳期的日产奶量，萨伊金公式表达式：w＝g
×
24/h。其中w表示24小时内的总产奶量，g是半天的总产奶量，h是24小时内机器挤奶的时间。试验期结束采用颈静脉采血。
51.(2)分子标记的获取
52.基于驴重测序结果，选择了基因的单核苷酸多态性(snp)，见表1。利用涉及获得相关特异性引物。引物序列见表2。pcr扩增量为10μl，2
×
kasp mix 5μl，100μm primer 1 0.015μl，100μm primer 2 0.015μl，100μm primer common 0.04μl，基因组dna 2μl，ddh2o补充至10μl。pcr条件为：94℃起始步骤(1个循环10min)，94℃10个循环20s，61℃45s，94℃35个循环20s，55℃20s。使用geneonbiotech公司的dna试剂盒分离基因组dna。竞争性等位基因特异性pcr(kasptm，lgc genomics，teddincton，middlesex，uk)基因分型对选取的3个snp进行双等位基因鉴别，输出89头新疆驴的基因型资料进行统计分析，分型结果见表3。
53.lgc genomics的基因分型结果用lgc genomics的douglas软件(www.lgcgroup.com)进行分析。采用χ2检验(χ2)确定群体是否处于hardy-weinberg平衡(hwe)，采用单因素方差分析(one-way anova)对多态snp进行遗传关联分析，并采用spss 27.0软件进行统计分析。数据用平均值
±
标准误表示。
54.表1：选择用于新疆驴基因分型研究的snp位点
55.基因gene id等位基因替换位点染色体号adcy8106824833c/t4836630212
56.表2：引物信息
[0057][0058]
表3：新疆驴多态snp和基因型频率列表
[0059][0060]
2.结果：
[0061]
2.1与产奶量相关的snp结果见表4。
[0062]
snp明显影响新疆驴产奶量，见表4。adcy8 g.48366302t》c的snp位点与新疆驴的产奶量相关，adcy8 g.48366302t》c突变体的tt值提高了泌乳后期的日产奶量(p《0.05)，说明tt型更有利于泌乳，新疆驴泌乳差异可能是由adcy8引起的。
[0063]
表4：新疆种驴产奶量相关snp
[0064][0065]
注：在同一列中，不同字母表示显著性差异(p《0.05)，同字母表示差异不显著(p》0.05)
[0066]
2.2与乳成分相关的snp结果。
[0067]
snp明显影响新疆驴乳成分见表5。adcy8 g.48366302t》c杂合体的ct型显著提高了乳脂率和蛋白率。提示新疆驴乳的乳脂率及乳蛋白率的差异可能是由adcy8引起的。
[0068]
表5：新疆种驴产奶量相关snp(％)
[0069][0070][0071]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。