苯丙氨酸在制备提高拮抗酵母生防效力防治枣果实采后病害的试剂中的应用

1.本发明属于果实采后病害生物防治技术领域，涉及苯丙氨酸在制备提高拮抗酵母生防效力防治枣果实采后病害的试剂中的应用。


背景技术：

2.拮抗酵母具有对极端环境耐受、能很快适应果实伤口的微环境、营养需求简单、不产致敏孢子或霉菌毒素等优点，是果实采后病害防治中常用的生物防治拮抗菌。
3.拮抗酵母控制果实采后病害主要有以下几种作用方式：与病原菌竞争营养物质与空间位点；形成生物膜；吸附寄生于病原菌；产生抑菌物质；诱导寄主产生抗病性。
4.然而目前利用拮抗酵母管理果实采后病害存在生防效力不稳定、效果不佳等问题，因此迫切需要通过有效途径来提高其防治效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于探究提高拮抗酵母生防效力的方法和试剂，以期为果实采后病害的防治提供新的解决方案。
6.经研究，本发明提供如下技术方案：
7.苯丙氨酸在制备提高拮抗酵母生防效力防治枣果实采后病害的试剂中的应用。
8.进一步，所述拮抗酵母为meyerozyma caribbica。
9.进一步，所述枣果实采后病害为黑斑病。
10.进一步，所述提高拮抗酵母生防效力是通过促进拮抗酵母形成生物膜来提高拮抗酵母生防效力。
11.枣果实在采后极易发生潜伏侵染性病害而造成重大损失。研究发现，拮抗酵母m. caribbica通过损伤接种能够有效防治枣果实采后黑斑病，其主要生防机制是营养空间竞争与生物膜的形成。本发明研究证明，外源苯丙氨酸预处理能促进拮抗酵母m.caribbica生物膜的形成，从而提高拮抗酵母m.caribbica对枣果实采后黑斑病的生防效力。
12.本发明的有益效果在于：本发明提供了苯丙氨酸在制备提高拮抗酵母生防效力防治枣果实采后病害的试剂中的应用，为增强拮抗酵母的生防效力提供了新的方法和试剂，也为枣果实采后病害的防治提供了新的解决方案。
附图说明
13.图1为苯丙氨酸处理对m.caribbica生物量的影响。
14.图2为苯丙氨酸处理对m.caribbica生物膜形成的影响，不同字母表示差异显著(p《0.05)。
15.图3为苯丙氨酸处理对m.caribbica控制枣果实采后黑斑病的生防效力影响，不同字母表示差异显著(p《0.05)。
16.图1和图3中m.c表示m.caribbica，phe表示苯丙氨酸，control表示对照。
具体实施方式
17.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
18.1研究材料
19.1.1枣果实
20.枣果实(zizyphus jujuba mill.cv.
‘
dong zao’)为商业成熟期的暖棚种植冬枣，采摘自山西省临汾市襄汾县邓庄镇席村(东经111.24
°
，北纬35.72
°
)。采摘后立即运回实验室。选取大小均匀、成熟度一致、无机械损伤及病虫害的枣果实，摊开散田间热24h，然后随机分组备用。
21.1.2酵母菌
22.酵母菌m.caribbica是从重庆市忠县区夏橙果实表面分离得到，置于30％的甘油中，-80℃长期保存。使用前，将酵母菌在nyda培养基上连续传代2次进行活化，之后接种到100mlnydb液体培养基中，28℃、200rmp培养16-18h，离心(5000
×
g，5min，4℃)收集酵母细胞，用无菌水洗涤2次，用血球计数板计数，并稀释至所需试验浓度。
23.2实验方法
24.2.1苯丙氨酸处理对m.caribbica生物量的影响
25.将m.caribbica的胞悬液(1
×
108cells
·
ml-1
)以1
‰
的接种量分别接种于添加含有0、1、 2、4、8mm苯丙氨酸的100ml nydb培养基中，28℃、200rpm培养。每隔4h取样测定m.caribbica的生物量。
26.2.2苯丙氨酸处理对m.caribbica生物膜形成的影响
27.将m.caribbica在ynb(含葡萄糖100mmol
·
l-1
)培养基中28℃过夜培养，离心收集酵母细胞，用ynb调整细胞浓度为1
×
107cells
·
ml-1
；取100μl加入到96孔聚苯乙烯板孔内， 28℃、75rpm培养，分别在培养3、8、24、48、72h后，用无菌水洗涤，加入100μl 0.4％结晶紫溶液染色45min，再用无菌水洗涤，加入200μl 95％乙醇脱色45min；取100μl脱色液到另一块96孔聚苯乙烯板孔内，于590nm处测定吸光值。吸光值的大小用来表示生物膜生成量的多少。以不接种酵母的ynb(含葡萄糖100mmol
·
l-1
)培养基校正空白，每个处理 3个重复，每个重复8个复孔。
28.2.3苯丙氨酸处理对m.caribbica控制枣果实采后黑斑病的生防效力影响
29.将m.caribbica的胞悬液(1
×
108cells
·
ml-1
)以1
‰
的接种量分别接种于添加含有0、1、 2、4、8mm苯丙氨酸的100ml nydb培养基中，28℃、200rmp培养16-18h，离心收集酵母细胞，用无菌水洗涤并调整细胞浓度至1
×
108cells
·
ml-1
。挑选大小一致并无机械损伤的枣果实，用2％次氯酸钠溶液浸泡果实2min进行表面消毒，随后清水冲洗晾干，用无菌打孔器在果实赤道部位等距打2个小孔(直径3mm，深3mm)，接入20μl上述酵母细胞悬液，4 小时后，接种10μl 1
×
106spores/ml链格孢孢子悬浮液，待液体吸收完全后，放置于25℃、相对湿度90-95％的环境中贮藏。观察记录发病率及病斑直径。
30.3实验结果
31.3.1苯丙氨酸处理对m.caribbica生长量的影响
32.如图1所示，培养0-16h，苯丙氨酸的添加促进m.caribbica的生长(培养16h，未添加苯丙氨酸的酵母od
600
为1.32，添加8mm苯丙氨酸的酵母od
600
为1.40)，此阶段的酵母生长速率最快、活性最好，是控制病害的最佳时间段；随着培养时间的延长，苯丙氨酸的添加促进酵母代谢物的积累，可能导致酵母生长延缓。
33.3.2苯丙氨酸处理对m.caribbica生物膜形成的影响
34.如图2所示，在培养3-72h内，未经苯丙氨酸处理(0mm)和经苯丙氨酸处理(1-8mm) 的酵母，用无菌水反复数次清洗后仍然能稳定地附着在96孔聚苯乙烯板上，表明其生物膜形成能力较强；在培养8h，经1mm、8mm苯丙氨酸处理的酵母的生物膜形成能力最强，显著高于未经苯丙氨酸处理的酵母(p《0.05)。
35.3.3苯丙氨酸处理对m.caribbica控制枣果实采后黑斑病的生防效力影响
36.如图3所示，与未接种酵母的对照组果实相比，各酵母处理组均能显著控制枣果实采后黑斑病的发展，果实的发病率和病斑直径均显著降低(p《0.05)；经8mm苯丙氨酸处理的酵母组果实，从贮藏的第4d起，发病率和病斑直径均低于未经苯丙氨酸处理的酵母组果实 (p《0.05)。
37.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。