用于诊断胃癌的甲基化生物标记物、试剂盒及用途的制作方法

本发明属于生物，具体涉及用于诊断胃癌的甲基化生物标记物、试剂盒及用途，更具体地，涉及用于辅助临床检测胃癌的基于血浆中cfdna的甲基化标记物。

背景技术：

1、胃癌(gastric carcinoma,gc)是最常见的消化道肿瘤之一，严重威胁人类的生命健康。早期诊断、早期治疗对于提高胃癌治疗疗效、降低病死率具有重要意义。目前针对胃部肿瘤的检测，常用筛查方法主要有以下形式：1)胃镜检查，胃镜检查是将一种特制的管道由口腔经食管置入胃腔，肉眼直接观察各部位胃黏膜的变化，如充血、水肿、萎缩、溃疡、出血、炎症以及肿瘤等。当胃镜检查发现食管、胃或十二指肠有可疑病灶时，可用胃镜前端特有的活检钳钳取活体组织进行病理学检查，这样可确定病变部位的病变性质，及时发现早期胃癌。2)血清胃蛋白酶原(pepsinogen，pg)检测：pg是胃蛋白酶的无活性前体。根据生物化学和免疫活性特征，pg可分为pgⅰ和pgⅱ两种亚型。pgⅰ主要由胃体和胃底腺的主细胞和颈黏液细胞分泌，而pgⅱ除了由胃底腺分泌外，胃窦幽门腺和近端十二指肠布路纳氏腺(brunner′s gland)也可以分泌。pg是反映胃体胃窦黏膜外分泌功能的良好指标，可称之为"血清学活组织检查"，然而这种方法的检测敏感度和特异性有限。3)x线钡餐检查：x线钡餐检查是通过喝下不透x线的钡剂，让它涂抹在胃黏膜的表面。钡剂所到之处通过摄片，可较清晰地显示出来，在观察食管及胃的形态的同时，间接地反映胃黏膜有无病变。当有肿瘤存在时，可在钡剂所覆盖处出现充盈缺损的影像。

2、然而上述手段存在以下问题：肿瘤标记物整体上的灵敏度与特异性不高，受其他的生理条件或者个体情况影响比较大，有创的检测对患者身体产生伤害，降低患者对检测的依从性，这些不足限制这些检测方法在胃癌早期筛查的临床价值。比如影像学手段主要在于有一定的辐射影响，且受到设备的影响，像x线-气钡双重造影受操作者经验影响较大，其早期胃癌诊断率低。胃镜是胃癌早期检测的金标准，但是存在有创侵入性等问题，患者依从性低。胃镜检查也会有一些并发症，其中较严重的并发症有心肺意外、严重出血、穿孔以及感染等。胃镜检查时咽部的刺激感和腹部的胀气感，难免会令一些患者望而却步，同时它也不适合病情较重的患者，如大出血、休克、心脏不好、昏迷不能配合以及年迈体虚者。针对目前的癌种早诊、早筛需求，基于血液的多癌种甚至于泛癌种是最为关键的预防、诊断手段，相比较传统的手段，基于血液的胃癌液体活检具有以下优势：1)无创性，不需要类似于内窥镜进行侵入性检测，患者依从性高；2)便捷性，因为仅需要简单采血即可实现，不需要借助大型仪器设备，容易在人群中推广；3)性能好，相比其他的肿瘤标记物检测方式，分子检测的整体灵敏度与特异性相对较高；4)结果相对比较客观，不依赖于具体从业人员的主观判断，结果呈现比较客观，易解读；5)可实现多癌种的联合检测，避免过高的累积假阴或者假阳结果，缓解一定的医疗焦虑。

3、目前也有研究开展胃癌早筛的液体活检的项目，如博尔诚(北京)科技有限公司提供的基于血液甲基化和qpcr平台，该公司的产品检测胃癌的灵敏度为61.76％，特异性为85.07％，优于一般传统胃癌检测的方法。但是在临床应用场景下，较高的敏感度和特异性，才能够减少误诊和漏诊事件，进一步提高检测性能对辅助胃癌检测是必要的。

4、本发明申请人基于血液甲基化信号并采用多重pcr(multiplex polymerasechain reaction,mpcr)+下一代测序(next generation sequencing,ngs)的特殊信号检测平台方法，先把dna分子甲基化信号放大再做ngs测序分析，这样可以提高甲基化信号的信噪比，且相比于qpcr平台，本发明申请人的平台方法能得到具体的dna分子的甲基化模式，分辨率达到单碱基，为后续生物信息分析提供更多的信息，最终的结果显示具有更优越的敏感度和特异性。并由此获得了具有高敏感度和特异性的用于诊断胃癌的标记物和标记物组合，用于辅助临床检测/诊断胃癌。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、针对目前胃癌检测在临床上应用存在的有创，患者依从性差，敏感度和特异性低等问题，本发明开发一种用于诊断胃癌的标记物，具体为基于血液的甲基化标记物，其可采用mpcr+ngs平台/方法进行检测，进一步增强标记物信号差异。

3、用于解决问题的方案

4、在本发明的第一方面中，提出一种用于诊断胃癌/辅助临床检测胃癌的甲基化生物标记物。具体地，本发明提供了一种用于诊断胃癌的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包括选自以下的差异甲基化区域中的任一项或其任意组合：

5、chr8:70984561-70984656、chr4:13536950-13537044、chr8:99961207-99961337、chr10:110225862-110225977、chr4:13526663-13526744、chr13:46960844-46960969、chr2:213401681-213401784、chr4:154713804-154713923、chr5:92907913-92908009、chr7:96651472-96651564、chr4:13524667-13524790、chr11:125037244-125037331、chr4:144620968-144621093、chr17:66596160-66596269、chr8:26722886-26723016、chr8:143532011-143532108、chr8:24770917-24771026、chr7:139333352-139333459、chr6:40996087-40996182、chr5:172673057-172673162、chr1:47899550-47899648、chr7:27253040-27253164、chr6:133561659-133561777、chr8:99962607-99962690、chr5:140871302-140871422、chr8:10588845-10588971、chr8:132053717-132053827、chr10:28030375-28030474、chr7:150038594-150038715、chr13:36049329-36049419、chr15:96895487-96895582、chr12:115109503-115109616、chr8:132054559-132054681、chr8:54164381-54164463、chr4:13532565-13532660、chr11:61544752-61544867、chr9:91605729-91605817、chr17:46673962-46674085、chr14:103512082-103512178、chr8:132052701-132052859、chr5:134376436-134376563、chr7:1094829-1094913、chr14:99697596-99697701、chr15:96887526-96887616、chr7:27196279-27196357、chr3:138665164-138665243、chr10:90343168-90343288、chr2:154335349-154335456、chr2:176972076-176972174、chr5:112073351-112073434、chr6:31830674-31830762、chr2:177053257-177053351、chr22:25961206-25961295、chr10:85955208-85955302、chr16:82661134-82661236、chr20:2781337-2781445、chr5:475141-475226、chr15:48010834-48010923、chr2:176994614-176994699、chr9:23822006-23822117、chr9:126771376-126771460、chr2:200328933-200329042、chr4:111544276-111544375、chr3:152553579-152553708、chr5:32714407-32714525。

6、在一些实施方案中，所述的差异甲基化区域至少包括：chr10:90343168-90343288、chr5:92907913-92908009、chr15:96895487-96895582中的至少一种。

7、在一些具体的实施方案中，所述的差异甲基化区域还包括chr5:112073351-112073434、chr4:13524667-13524790中的至少一种；

8、任选地，所述的差异甲基化区域还包括chr4:13526663-13526744、chr7:27253040-27253164、chr8:132054559-132054681、chr8:99962607-99962690、chr6:133561659-133561777中的至少一种；

9、任选地，所述的差异甲基化区域还包括chr8:10588845-10588971、chr17:66596160-66596269、chr8:132053717-132053827、chr14:99697596-99697701、chr9:91605729-91605817、chr5:140871302-140871422、chr5:134376436-134376563、chr1:47899550-47899648、chr8:143532011-143532108、chr9:126771376-126771460中的至少一种；

10、任选地，所述的差异甲基化区域还包括chr17:46673962-46674085、chr2:176994614-176994699、chr7:1094829-1094913、chr4:144620968-144621093、chr13:46960844-46960969、chr2:213401681-213401784、chr7:139333352-139333459、chr15:96887526-96887616、chr5:32714407-32714525、chr20:2781337-2781445、chr4:13532565-13532660、chr14:103512082-103512178、chr12:115109503-115109616、chr7:96651472-96651564、chr10:85955208-85955302、chr2:177053257-177053351、chr22:25961206-25961295、chr5:112073351-112073434、chr6:31830674-31830762、chr7:27196279-27196357、chr11:61544752-61544867、chr8:99961207-99961337、chr7:150038594-150038715、chr6:40996087-40996182、chr4:13536950-13537044、chr13:36049329-36049419、chr3:152553579-152553708、chr5:172673057-172673162、chr10:110225862-110225977、chr15:48010834-48010923中的至少一种。

11、在另一些具体的实施方案中，所述的差异甲基化区域还包括chr9:126771376-126771460、chr6:133561659-133561777中的至少一种；

12、任选地，所述的差异甲基化区域还包括chr8:10588845-10588971、chr5:112073351-112073434、chr8:70984561-70984656、chr7:27253040-27253164、chr7:27196279-27196357中的至少一种；

13、任选地，所述的差异甲基化区域还包括chr11:125037244-125037331、chr5:140871302-140871422、chr14:103512082-103512178、chr2:213401681-213401784、chr20:2781337-2781445、chr12:115109503-115109616、chr17:46673962-46674085、chr7:150038594-150038715、chr8:132053717-132053827、chr5:32714407-32714525中的至少一种；

14、任选地，所述的差异甲基化区域还包括chr5:134376436-134376563、chr8:132054559-132054681、chr3:138665164-138665243、chr4:144620968-144621093、chr8:99961207-99961337、chr13:36049329-36049419、chr7:139333352-139333459、chr10:28030375-28030474、chr4:13526663-13526744、chr8:24770917-24771026、chr4:13536950-13537044、chr3:152553579-152553708、chr2:177053257-177053351、chr10:85955208-85955302、chr5:112073351-112073434、chr22:25961206-25961295、chr9:91605729-91605817、chr8:143532011-143532108、chr2:176972076-176972174、chr10:110225862-110225977、chr8:99962607-99962690、chr6:40996087-40996182、chr11:61544752-61544867、chr8:132052701-132052859、chr15:96887526-96887616、chr9:23822006-23822117、chr5:172673057-172673162、chr4:13532565-13532660、chr1:47899550-47899648、chr17:66596160-66596269中的至少一种。

15、在一些更具体的实施方案中，所述的差异甲基化区域包括chr8:70984561-70984656、chr4:13536950-13537044、chr8:99961207-99961337、chr10:110225862-110225977、chr4:13526663-13526744、chr13:46960844-46960969、chr2:213401681-213401784、chr4:154713804-154713923、chr5:92907913-92908009、chr7:96651472-96651564、chr4:13524667-13524790、chr11:125037244-125037331、chr4:144620968-144621093、chr17:66596160-66596269、chr8:26722886-26723016、chr8:143532011-143532108、chr8:24770917-24771026、chr7:139333352-139333459、chr6:40996087-40996182、chr5:172673057-172673162、chr1:47899550-47899648、chr7:27253040-27253164、chr6:133561659-133561777、chr8:99962607-99962690、chr5:140871302-140871422、chr8:10588845-10588971、chr8:132053717-132053827、chr10:28030375-28030474、chr7:150038594-150038715、chr13:36049329-36049419、chr15:96895487-96895582、chr12:115109503-115109616、chr8:132054559-132054681、chr8:54164381-54164463、chr4:13532565-13532660、chr11:61544752-61544867、chr9:91605729-91605817、chr17:46673962-46674085、chr14:103512082-103512178、chr8:132052701-132052859、chr5:134376436-134376563、chr7:1094829-1094913、chr14:99697596-99697701、chr15:96887526-96887616、chr7:27196279-27196357、chr3:138665164-138665243、chr10:90343168-90343288、chr2:154335349-154335456、chr2:176972076-176972174、chr5:112073351-112073434、chr6:31830674-31830762、chr2:177053257-177053351、chr22:25961206-25961295、chr10:85955208-85955302、chr16:82661134-82661236、chr20:2781337-2781445、chr5:475141-475226、chr15:48010834-48010923、chr2:176994614-176994699、chr9:23822006-23822117、chr9:126771376-126771460、chr2:200328933-200329042、chr4:111544276-111544375、chr3:152553579-152553708、chr5:32714407-32714525。

16、在一些实施方案中，所述胃癌选自i期、ii期、iii期或iv期的胃癌。

17、在一些实施方案中，所述胃癌为来自受试者的胃癌，所述的受试者是哺乳动物；优选地，所述的哺乳动物是人。

18、在一些实施方案中，待测样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平，相对于未患有胃癌的受试者的样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平存在差异，则指示所述待测样本对应的受试者存在胃癌。

19、在一些实施方案中，所述差异甲基化区域为存在于cfdna中的差异甲基化区域。

20、在本发明的第二方面中，提供了以下(i)～(ii)中任一用途：

21、(i)本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物在制备用于诊断胃癌的试剂或试剂盒中的用途；

22、(ii)确定本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物的甲基化水平的试剂在制备用于诊断胃癌的试剂或试剂盒中的用途。

23、在本发明的第三方面中，提供了一种用于诊断胃癌的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物的甲基化水平的试剂。

24、在一些实施方案中，所述试剂盒采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术和基因测序技术中的一种或多种对本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物的甲基化水平进行检测。

25、在一些具体的实施方案中，所述的试剂盒中的所述试剂包括引物和/或探针；其中，所述引物扩增包含本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物的序列；所述探针至少部分地与本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物的序列杂交。

26、在一些更具体的实施方案中，所述试剂包括选自以下的至少一组引物对：

27、如seq id no:1～2所示的引物；如seq id no:3～4所示的引物；如seq id no:5～6所示的引物；如seq id no:7～8所示的引物；如seq id no:9～10所示的引物；如seq idno:11～12所示的引物；如seq id no:13～14所示的引物；如seq id no:15～16所示的引物；如seq id no:17～18所示的引物；如seq id no:19～20所示的引物；如seq id no:21～22所示的引物；如seq id no:23～24所示的引物；如seq id no:25～26所示的引物；如seqid no:27～28所示的引物；如seq id no:29～30所示的引物；如seq id no:31～32所示的引物；如seq id no:33～34所示的引物；如seq id no:35～36所示的引物；如seq id no:37～38所示的引物；如seq id no:39～40所示的引物；如seq id no:41～42所示的引物；如seq id no:43～44所示的引物；如seq id no:45～46所示的引物；如seq id no:47～48所示的引物；如seq id no:49～50所示的引物；如seq id no:51～52所示的引物；如seq idno:53～54所示的引物；如seq id no:55～56所示的引物；如seq id no:57～58所示的引物；如seq id no:59～60所示的引物；如seq id no:61～62所示的引物；如seq id no:63～64所示的引物；如seq id no:65～66所示的引物；如seq id no:67～68所示的引物；如seqid no:69～70所示的引物；如seq id no:71～72所示的引物；如seq id no:73～74所示的引物；如seq id no:75～76所示的引物；如seq id no:77～78所示的引物；如seq id no:79～80所示的引物；如seq id no:81～82所示的引物；如seq id no:83～84所示的引物；如seq id no:85～86所示的引物；如seq id no:87～88所示的引物；如seq id no:89～90所示的引物；如seq id no:91～92所示的引物；如seq id no:93～94所示的引物；如seq idno:95～96所示的引物；如seq id no:97～98所示的引物；如seq id no:99～100所示的引物；如seq id no:101～102所示的引物；如seq id no:103～104所示的引物；如seq id no:105～106所示的引物；如seq id no:107～108所示的引物；如seq id no:109～110所示的引物；如seq id no:111～112所示的引物；如seq id no:113～114所示的引物；如seq idno:115～116所示的引物；如seq id no:117～118所示的引物；如seq id no:119～120所示的引物；如seq id no:121～122所示的引物；如seq id no:123～124所示的引物；如seq idno:125～126所示的引物；如seq id no:127～128所示的引物；如seq id no:129～130所示的引物。

28、在一些实施方案中，所述的待测样本选自组织、全血、血浆、血清、胸腔积液、腹水、羊水、唾液、骨髓、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种；优选地，所述的待测样本为全血、血浆或血清。

29、在本发明的第四方面中，提供了一种诊断胃癌的系统，其中，所述系统包括检测装置、计算装置和输出装置；

30、所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样本，所述检测器用于检测所述样本中上述的甲基化生物标记物的甲基化水平；

31、所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：

32、所述样本中本发明第一方面中所述的甲基化生物标记物的甲基化水平不同于未患有胃癌的受试者的样本中测定的甲基化生物标记物的甲基化水平，则判别所述样本对应的受试者的存在胃癌。

33、在本发明的第五方面中，提供了选自以下的引物的组合的至少一组在制备用于诊断胃癌的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述引物用于检测本发明第一方面中所述的甲基化生物标记物的甲基化程度：

34、如seq id no:1～2所示的引物；如seq id no:3～4所示的引物；如seq id no:5～6所示的引物；如seq id no:7～8所示的引物；如seq id no:9～10所示的引物；如seq idno:11～12所示的引物；如seq id no:13～14所示的引物；如seq id no:15～16所示的引物；如seq id no:17～18所示的引物；如seq id no:19～20所示的引物；如seq id no:21～22所示的引物；如seq id no:23～24所示的引物；如seq id no:25～26所示的引物；如seqid no:27～28所示的引物；如seq id no:29～30所示的引物；如seq id no:31～32所示的引物；如seq id no:33～34所示的引物；如seq id no:35～36所示的引物；如seq id no:37～38所示的引物；如seq id no:39～40所示的引物；如seq id no:41～42所示的引物；如seq id no:43～44所示的引物；如seq id no:45～46所示的引物；如seq id no:47～48所示的引物；如seq id no:49～50所示的引物；如seq id no:51～52所示的引物；如seq idno:53～54所示的引物；如seq id no:55～56所示的引物；如seq id no:57～58所示的引物；如seq id no:59～60所示的引物；如seq id no:61～62所示的引物；如seq id no:63～64所示的引物；如seq id no:65～66所示的引物；如seq id no:67～68所示的引物；如seqid no:69～70所示的引物；如seq id no:71～72所示的引物；如seq id no:73～74所示的引物；如seq id no:75～76所示的引物；如seq id no:77～78所示的引物；如seq id no:79～80所示的引物；如seq id no:81～82所示的引物；如seq id no:83～84所示的引物；如seq id no:85～86所示的引物；如seq id no:87～88所示的引物；如seq id no:89～90所示的引物；如seq id no:91～92所示的引物；如seq id no:93～94所示的引物；如seq idno:95～96所示的引物；如seq id no:97～98所示的引物；如seq id no:99～100所示的引物；如seq id no:101～102所示的引物；如seq id no:103～104所示的引物；如seq id no:105～106所示的引物；如seq id no:107～108所示的引物；如seq id no:109～110所示的引物；如seq id no:111～112所示的引物；如seq id no:113～114所示的引物；如seq idno:115～116所示的引物；如seq id no:117～118所示的引物；如seq id no:119～120所示的引物；如seq id no:121～122所示的引物；如seq id no:123～124所示的引物；如seq idno:125～126所示的引物；如seq id no:127～128所示的引物；如seq id no:129～130所示的引物。

35、发明的效果

36、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

37、本发明的发明人发现包括chr10:90343168-90343288、chr15:96895487-96895582、chr20:2781337-2781445、chr4:13526663-13526744、chr5:92907913-92908009、chr5:112073351-112073434、chr5:134376436-134376563、chr5:140871302-140871422、chr6:133561659-133561777、chr7:27253040-27253164、chr8:10588845-10588971、chr8:24770917-24771026、chr8:99962607-99962690、chr8:132053717-132053827、chr8:132054559-132054681等在内的共65种dna甲基化区域，通过针对这些区域的不同组合检测，采用随机森林或者逻辑回归等方式建立预测模型，发现其对检测胃癌病变的准确性提高有很大帮助，可以作用辅助胃癌检测的标记物。本发明采用联合多个甲基化区域信号来评估甲基化差异的程度，克服单个dna甲基化信号不足的问题，并提高检测的灵敏度和特异性，从而为胃癌检测等应用提供更为有效地辅助检测服务。同时，本发明提供的甲基化区域单独作为胃癌检测标记物也具有良好的灵敏度和特异性。本发明还在对照组添加了良性和几种其他高发癌种样本，以便能够区别胃部良性病变和其他非胃癌的肿瘤患者，以保证检测出胃癌的特异性。本发明通过甲基化多重特异性扩增+ngs测序的方法，结合在生物标记物上面的筛选策略，达到了几个主要的技术效果：相比较捕获的方法，扩增子的方法在整体的费用上面以及周转时长有比较大的优势；利用多重甲基化特异性扩增的方式，因为会特异性扩增选定的生物标记物，提高了信噪比，所以一定程度上更小的panel可以达到类似于捕获手段需要更大的panel，从而极大地节省了测序成本以及分析的信噪比，从而使得整体的数据分析以及模型建立更稳定，更容易进行泛化。