本发明属于分子生物学和光电子学,具体涉及一种基于crispr技术与表面等离子共振技术的核酸检测试剂盒及其应用。
背景技术:
1、sars-cov-2是一种β属的新型冠状病毒,呈圆形或椭圆形,直径60-140nm,电镜下呈皇冠样形状,可感染哺乳动物和人。目前,sars-cov-2已出现alpha、beta、gamma、delta和omicron突变体。其中,omicron变体已成为最受关注的变体。现阶段,sars-cov-2阳性样本仍主要通过聚合酶链式反应(pcr)进行检测,而变异体类型则依靠基因测序来确定。然而目前的pcr检测只能对sars-cov-2进行一般性检测,而不能对特定的毒株进行分型检测。基因测序方法虽稳定、可靠,但样本处理复杂,且对仪器要求高,耗时长。因此,新的核酸分子检测方法需要克服常规核酸检测策略的局限性,以提供低成本、高集成度、紧凑便捷的核酸诊断工具,从而扩展其临床应用。
2、在最近的研究中,基于常间回文重复序列丛集(crispr)及相关的核酸酶(cas)的技术已经与光学检测方法结合用于常规的核酸检测。其中,crispr-cas蛋白在单链引导rna(sgrna)分子的引导下,可以成为靶向特异性序列的强大工具。例如,“sherlock”方法先通过rpa或rt-rpa技术对待测序列进行扩增,然后利用引导rna与crispr相关核酸酶13(cas13a)的复合物与待测物进行反应,若待测物中含有与目标序列一致的核酸片段,则依核酸片段浓度的不同产生荧光信号。又如“holmes”方法,因为使用可直接靶向dna分子的cas12a而无需经过“sherlock”方法中dna向rna的转录过程。无论是“sherlock”还是“holmes”方法,二者都可以通过单链核酸探针来对dna分子或rna分子进行序列特异性检测。由于crispr-cas系统中的sgrna具有极强的可设计性,因此可以通过简单更改sgrna序列以检测不同的目标序列核酸分子。
3、表面等离子共振技术,英文简写spr,是从20世纪90年代发展起来的一种高灵敏度光学检测技术,利用该技术研制出的spr传感器是一种高分辨率光学折射率传感器,可以用于检测折射率极为微小的变化。利用spr原理开发的生物传感器可以被视为“超微量天平”用于检测分析生物分子之间相互作用的情况,并已被广泛应用于诸如大分子检测、药物筛选、蛋白质相互作用、临床诊断、细胞膜模拟、遗传分析等多个领域。但是目前尚无将crispr技术和表面等离子共振技术联合用于新型冠状病毒核酸检测及分型检测。
技术实现思路
1、本发明的第一方面的目的,在于提供一种试剂盒。
2、本发明的第二方面的目的,在于提供一种系统。
3、本发明的第三方面的目的,在于提供本发明第一方面的试剂盒和/或本发明第二方面的系统的应用。
4、本发明的第四方面的目的,在于提供一种方法。
5、为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
6、本发明的第一个方面,提供一种试剂盒,包含:spr生物传感器芯片、h1、h2和h3;所述h1的核苷酸序列为n1 n2……nnttattattnn+1nn+2……nn+m;所述n为a、t、c或g;所述m、n独立选自于:10、11、12、13、14、15、16;所述试剂盒用于检测核酸;
7、所述h2与所述h1的5’端反向互补,所述h3与所述h1的3’端反向互补;或
8、所述h2与所述h1的3’端反向互补,所述h3与所述h1的5’端反向互补。
9、优选地,所述h2与所述h1的5’端反向互补,所述h3与所述h1的3’端反向互补。
10、优选地,所述h2的碱基数为n~n+4;进一步为n+4。
11、优选地,所述h3的碱基数为m~m+4;进一步为m+4。
12、优选地,所述h2的碱基数为15。
13、优选地,所述h3的碱基数为16。
14、优选地,所述h1、h2、h3中至少一种修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物,即可以是:
15、h1、h2或h3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物;或
16、h1及h2、h1及h3、或h1及h3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物;或
17、h1、h2和h3均修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物。
18、优选地,所述h3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物(纳米金h3偶联物,h3@aunps)。
19、优选地,所述纳米金的直径为8~20nm;进一步为10~15nm。
20、优选地,所述核酸-纳米金偶联物的制备方法为本领域常规方法,具体如下:将核酸与纳米金混合,冷冻,融化,得到。
21、优选地,所述核酸与纳米金的摩尔比为5000:(1~25);进一步为5000:(2~24)。
22、优选地,所述冷冻的条件为-20~-80℃冷冻1~4h。
23、优选地,所述融化的条件为恢复到室温待其融化。
24、优选地,所述融化后还包括如下步骤:离心、洗涤、分散。
25、优选地,所述离心的条件为8000~13000rpm离心10~15min。
26、优选地,所述h1的序列为ctttactcaacttattattacgaacatcagg(seq id no.1)。
27、优选地,所述h2的序列为ataagttgagtaaag(seq id no.2)。
28、优选地,所述h3的序列为cctgatgttcgtaata(seq id no.3)。
29、优选地,所述spr生物传感芯片是一种基底为高透光玻璃且表面具有纳米级贵金属镀层的光学芯片。
30、优选地,所述贵金属包括金、银、铜中的至少一种;进一步优选地,所述贵金属包括金。
31、优选地,所述spr生物传感器芯片可以通过市购得到,也可以采用本领域常规方法制备得到。
32、优选地,所述spr生物传感芯片是通过物理气相沉积(pvd)法在厚度为50~300μm的高透光玻璃片表面沉积厚度为40~50nm的贵金属镀层制备而得。
33、优选地,spr生物传感器芯片包括spr裸金芯片。
34、优选地,所述试剂盒还包含:crrna及cas蛋白;所述核酸的序列包含靶核酸序列;所述crrna包含锚定序列和向导序列,所述锚定序列与所述cas蛋白特异性结合,所述向导序列与所述靶核酸序列相同或与所述靶核酸序列反向互补。
35、优选地,所述cas蛋白包括cas12a、cas12b、cas13a、cas13b中的至少一种;进一步优选地,所述cas蛋白包括cas12a。
36、优选地,所述crrna从5’端到3’端依次包含锚定序列和向导序列。
37、优选地,所述crrna的长度为29~56bp。
38、优选地,所述crrna的向导序列(与靶核酸序列相同或反向互补的序列)的长度为8~35bp。
39、优选地,所述核酸包括dna和rna中的至少一种。
40、优选地,所述dna包括ssdna和dsdna中的至少一种;进一步包括dsdna。
41、优选地,所述核酸来自动物、植物或微生物样品。
42、优选地,所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
43、优选地,所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
44、优选地,所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
45、优选地,所述核酸来自病毒。
46、优选地,所述核酸为sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2 omicron变异株s基因、sars-cov-2 delta变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因中的至少一种。
47、优选地,所述sars-cov-2保守序列n基因的靶核酸序列为cccccagcgcuucagcguuc(seq id no.5)。
48、优选地,所述sars-cov-2 omicron变异株s基因的靶核酸序列为aaugauaucuuuucacgucu(seq id no.9)。
49、优选地,所述sars-cov-2 delta变异株s基因的靶核酸序列为caagugcacuuggaaaacuu(seq id no.11)。
50、优选地,所述sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列为cuuguuaaacaacuuagcuc(seq id no.13)。
51、优选地,所述核酸为sars-cov-2保守序列n基因时,所述crrna的向导序列为cccccagcgcuucagcguuc(seq id no.16)。
52、优选地,所述核酸为sars-cov-2 omicron变异株s基因时,所述crrna的向导序列为aaugauaucuuuucacgucu(seq id no.17)。
53、优选地,所述核酸为sars-cov-2 delta变异株s基因时,所述crrna的向导序列为aaguuuuccaagugcacuug(seq id no.18)。
54、优选地,所述核酸为sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因时,所述crrna的向导序列为gagcuaaguuguuuaacaag(seq id no.19)。
55、优选地,所述cas蛋白为cas12a时,所述crrna的锚定序列为uaauuucuacuaaguguagau(seq id no.20)。
56、优选地,所述试剂盒还包含:用于扩增包含所述靶核酸序列的核酸分子的引物。
57、优选地,所述试剂盒还包含:蛋白酶k、反应buffer、pbs缓冲液中的至少一种;进一步优选的,所述试剂盒还包含:蛋白酶k、反应buffer和pbs缓冲液。
58、优选地,所述反应buffer包含:nacl、tris-hcl、mgcl2、牛血清白蛋白中的至少一种;进一步优选地,所述反应buffer包含:nacl、tris-hcl、mgcl2和牛血清白蛋白;更进一步优选地,所述反应buffer包含:20~100mm nacl、5~20mm tris-hcl、5~20mm mgcl2和0~200μg/l牛血清白蛋白。
59、优选地,所述反应buffer为nebuffer2.1。
60、优选地,一种用于新型冠状病毒基因分型的试剂盒,包含:crrna-d、crrna-o、crrna-ba、crrna-n中的至少一种;和
61、spr生物传感器芯片、h1、h2、h3和cas蛋白;
62、所述h1的核苷酸序列为n1 n2……nnttattattnn+1nn+2……nn+m;所述n为a、t、c或g;所述m、n独立选自于:10、11、12、13、14、15、16;所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba分别用于检测sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2 delta变异株s基因、sars-cov-2omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因;所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba均包含锚定序列和向导序列,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的锚定序列均与所述cas蛋白特异性结合,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的向导序列分别与所述sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2 delta变异株s基因、sars-cov-2 omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列相同或与所述sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2delta变异株s基因、sars-cov-2 omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列反向互补;
63、所述h2与所述h1的5’端反向互补,所述h3与所述h1的3’端反向互补;或
64、所述h2与所述h1的3’端反向互补,所述h3与所述h1的5’端反向互补。
65、优选地,所述试剂盒包含:crrna-d、crrna-o、crrna-ba中的至少一种;和
66、spr生物传感器芯片、h1、h2、h3、crrna-n和cas蛋白;
67、所述h1的核苷酸序列为n1 n2……nnttattattn n+1n n+2……n n+m;所述n为a、t、c或g;所述m、n独立选自于:10、11、12、13、14、15、16;所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba分别用于检测sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2 delta变异株s基因、sars-cov-2omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因;所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba均包含锚定序列和向导序列,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的锚定序列均与所述cas蛋白特异性结合,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的向导序列分别与所述sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2 delta变异株s基因、sars-cov-2 omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列相同或与所述sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2delta变异株s基因、sars-cov-2 omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列反向互补;
68、所述h2与所述h1的5’端反向互补,所述h3与所述h1的3’端反向互补;或
69、所述h2与所述h1的3’端反向互补,所述h3与所述h1的5’端反向互补。
70、优选地,所述试剂盒包含:crrna-d、crrna-o、crrna-ba、spr生物传感器芯片、h1、h2、h3、crrna-n和cas蛋白;
71、所述h1的核苷酸序列为n1 n2……nnttattattnn+1nn+2……nn+m;所述n为a、t、c或g;所述m、n独立选自于:10、11、12、13、14、15、16;所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba分别用于检测sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2 delta变异株s基因、sars-cov-2omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因;所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba均包含锚定序列和向导序列,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的锚定序列均与所述cas蛋白特异性结合,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的向导序列分别与所述sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2 delta变异株s基因、sars-cov-2 omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列相同或与所述sars-cov-2保守序列n基因、sars-cov-2delta变异株s基因、sars-cov-2 omicron变异株s基因、sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列反向互补;
72、所述h2与所述h1的5’端反向互补,所述h3与所述h1的3’端反向互补;或
73、所述h2与所述h1的3’端反向互补,所述h3与所述h1的5’端反向互补。
74、优选地,所述h2与所述h1的5’端反向互补,所述h3与所述h1的3’端反向互补。
75、优选地,所述h2的碱基数为n~n+4;进一步为n+4。
76、优选地,所述h3的碱基数为m~m+4;进一步为m+4。
77、优选地,所述h2的碱基数为15。
78、优选地,所述h3的碱基数为16。
79、优选地,所述h1、h2、h3中至少一种修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物,即可以是:
80、h1、h2或h3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物;或
81、h1及h2、h1及h3、或h1及h3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物;或
82、h1、h2和h3均修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物。
83、优选地,所述h3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物(纳米金h3偶联物,h3@aunps)。
84、优选地,所述纳米金的直径为8~20nm;进一步为10~15nm。
85、优选地,所述核酸-纳米金偶联物的制备方法为本领域常规方法,具体如下:将核酸与纳米金混合,冷冻,融化,得到。
86、优选地,所述核酸与纳米金的摩尔比为5000:(1~25);进一步为5000:(2~24)。
87、优选地,所述冷冻的条件为-20~-80℃冷冻1~4h。
88、优选地,所述融化的条件为恢复到室温待其融化。
89、优选地,所述融化后还包括如下步骤:离心、洗涤、分散。
90、优选地,所述离心的条件为8000~13000rpm离心10~15min。
91、优选地,所述h1的序列为ctttactcaacttattattacgaacatcagg(seq id no.1)。
92、优选地,所述h2的序列为ataagttgagtaaag(seq id no.2)。
93、优选地,所述h3的序列为cctgatgttcgtaata(seq id no.3)。
94、优选地,所述spr生物传感芯片是一种基底为高透光玻璃且表面具有纳米级贵金属镀层的光学芯片。
95、优选地,所述贵金属包括金、银、铜中的至少一种;进一步优选地,所述贵金属包括金。
96、优选地,所述spr生物传感器芯片可以通过市购得到,也可以采用本领域常规方法制备得到。
97、优选地,所述spr生物传感芯片是通过物理气相沉积(pvd)法在厚度为50~300μm的高透光玻璃片表面沉积厚度为40~50nm的贵金属镀层制备而得。
98、优选地,spr生物传感器芯片包括spr裸金芯片。
99、优选地,所述cas蛋白包括cas12a、cas12b、cas13a、cas13b中的至少一种;进一步优选地,所述cas蛋白包括cas12a。
100、优选地,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba从5’端到3’端依次包含锚定序列和向导序列。
101、优选地,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的长度均为29~56bp。
102、优选地,所述crrna-n、crrna-d、crrna-o、crrna-ba的向导序列(与靶核酸序列相同或反向互补的序列)的长度为8~35bp。
103、优选地,所述sars-cov-2保守序列n基因的靶核酸序列为cccccagcgcuucagcguuc(seq id no.5)。
104、优选地,所述sars-cov-2 omicron变异株s基因的靶核酸序列为aaugauaucuuuucacgucu(seq id no.9)。
105、优选地,所述sars-cov-2 delta变异株s基因的靶核酸序列为caagugcacuuggaaaacuu(seq id no.11)。
106、优选地,所述sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的靶核酸序列为cuuguuaaacaacuuagcuc(seq id no.13)。
107、优选地,所述crrna-n的序列如seq id no.4所示。
108、优选地,所述crrna-o的序列如seq id no.8所示。
109、优选地,所述crrna-d的序列如seq id no.10所示。
110、优选地,所述crrna-ba的序列如seq id no.12所示。
111、优选地,所述试剂盒还包含:用于扩增所述n基因和/或s基因的引物。
112、优选地,所述用于扩增所述n基因的引物的序列如seq id no.6、seq id no.7所示。
113、优选地,所述用于扩增所述s基因的引物的序列如seq id no.21、seq id no.22所示。
114、优选地,所述试剂盒还包含:蛋白酶k、反应buffer、pbs缓冲液中的至少一种;进一步优选的,所述试剂盒还包含:蛋白酶k、反应buffer和pbs缓冲液。
115、优选地,所述反应buffer包含:nacl、tris-hcl、mgcl2、牛血清白蛋白中的至少一种;进一步优选地,所述反应buffer包含:nacl、tris-hcl、mgcl2和牛血清白蛋白;更进一步优选地,所述反应buffer包含:20~100mm nacl、5~20mm tris-hcl、5~20mm mgcl2和0~200μg/l牛血清白蛋白。
116、优选地,所述反应buffer为nebuffer2.1。
117、本发明提供的用于新型冠状病毒基因分型的试剂盒基于光子crispr传感方法学(methodologies of photonic crispr sensing,mopcs),将crispr技术与表面等离子共振技术结合,可以实现新型冠状病毒的检测和/或分型。
118、本发明的第二个方面,提供一种系统,包含本发明第一个方面的试剂盒。
119、优选地,所述系统还包含:spr分子相互作用仪。
120、本发明的第三个方面,提供本发明第一个方面的试剂盒和/或本发明第二个方面的系统在(1)~(4)中任一项中的应用;
121、(1)非诊断目的地检测核酸;
122、(2)制备检测核酸的产品;
123、(3)非诊断目的的新型冠状病毒的检测和/或分型;
124、(4)制备新型冠状病毒的检测和/或分型的产品。
125、本发明的第四个方面,提供一种非诊断目的地检测核酸的方法,包括采用本发明的第一个方面的试剂盒和/或本发明第二个方面的系统的步骤。
126、优选地,所述方法包括如下步骤:
127、1)将spr生物传感器芯片装载到spr分子相互作用仪上;
128、2)向spr分子相互作用仪的流通池中加入pbs缓冲液,运行3~15min,记录终点信号spr1;
129、3)向流通池中加入h1,运行;
130、4)向流通池中加入pbs缓冲液,运行;
131、5)向流通池中加入h2、h3,运行;
132、6)向流通池中加入pbs缓冲液,运行3~30min,记录终点信号spr5;
133、7)向流通池中加入crispr反应体系,运行20~60min;所述crispr反应体系包含cas蛋白、crrna、反应buffer和待测核酸;
134、8)向流通池中加入蛋白酶k,运行;
135、9)向流通池中加入pbs缓冲液,运行10~60min,记录终点信号spr8;
136、10)计算δspr=(spr5-spr8)/(spr5-spr1)的比值。
137、优选地,所述方法包括如下步骤:
138、1)将spr生物传感器芯片装载到spr分子相互作用仪上;
139、2)向spr分子相互作用仪的流通池中加入pbs缓冲液,运行3~15min,记录终点信号spr1;
140、3)向流通池中加入h1,运行60~90min,记录终点信号spr2;
141、4)向流通池中加入pbs缓冲液,运行3~20min,记录终点信号spr3;
142、5)向流通池中加入h2、h3,运行45~160min,记录终点信号spr4;
143、6)向流通池中加入pbs缓冲液,运行3~30min,记录终点信号spr5;
144、7)向流通池中加入crispr反应体系,运行20~60min,记录终点信号spr6;所述crispr反应体系包含cas蛋白、crrna、反应buffer和待测核酸;
145、8)向流通池中加入蛋白酶k,运行10~70min,记录终点信号spr7;
146、9)向流通池中加入pbs缓冲液,运行10~60min,记录终点信号spr8;
147、10)计算δspr=(spr5-spr8)/(spr5-spr1)的比值。
148、优选地,所述h1的工作浓度为5~15μm;进一步为8~10μm。
149、优选地,所述h2的工作浓度为2~10μm;进一步为3.85~9.09μm。
150、优选地,所述h3的工作浓度为2~7μm;进一步为2.88~5.77μm。
151、优选地,所述cas蛋白的工作浓度为10~4000nm;进一步为80~400nm;更进一步为80~100nm。
152、优选地,所述crrna的工作浓度为10~4000nm;进一步为80~400nm;更进一步为80~100nm。
153、优选地,所述蛋白酶k为500~1500倍稀释后的蛋白酶k(全式金)。
154、优选地,所述待测核酸包括dna和rna中的至少一种。
155、优选地,所述dna包括ssdna和dsdna中的至少一种;进一步包括dsdna。
156、优选地,所述待测核酸来自动物、植物或微生物样品。
157、优选地,所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
158、优选地,所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
159、优选地,所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
160、优选地,所述待测核酸加入crispr反应体系前还可以包括如下步骤:对所述待测核酸进行逆转录和/或扩增。
161、一种非诊断目的的新型冠状病毒的检测和/或分型的方法,包括采用本发明的第一个方面的试剂盒和/或本发明第二个方面的系统的步骤。
162、优选地,所述方法包括如下步骤:
163、1)将spr生物传感器芯片装载到spr分子相互作用仪上;
164、2)向spr分子相互作用仪的流通池中加入pbs缓冲液,运行3~15min,记录终点信号spr1;
165、3)向流通池中加入h1,运行;
166、4)向流通池中加入pbs缓冲液,运行;
167、5)向流通池中加入h2、h3,运行;
168、6)向流通池中加入pbs缓冲液,运行3~30min,记录终点信号spr5;
169、7)向流通池中加入crispr反应体系,运行20~60min;所述crispr反应体系包含cas蛋白、crrna、反应buffer和待测核酸;
170、8)向流通池中加入蛋白酶k,运行;
171、9)向流通池中加入pbs缓冲液,运行10~60min,记录终点信号spr8;
172、10)计算δspr=(spr5-spr8)/(spr5-spr1)的比值。
173、优选地,所述方法包括如下步骤:
174、1)将spr生物传感器芯片装载到spr分子相互作用仪上;
175、2)向spr分子相互作用仪的流通池中加入pbs缓冲液,运行3~15min,记录终点信号spr1;
176、3)向流通池中加入h1,运行60~90min,记录终点信号spr2;
177、4)向流通池中加入pbs缓冲液,运行3~20min,记录终点信号spr3;
178、5)向流通池中加入h2、h3,运行45~160min,记录终点信号spr4;
179、6)向流通池中加入pbs缓冲液,运行3~30min,记录终点信号spr5;
180、7)向流通池中加入crispr反应体系,运行20~60min,记录终点信号spr6;所述crispr反应体系包含cas蛋白、crrna、反应buffer和待测核酸;
181、8)向流通池中加入蛋白酶k,运行10~70min,记录终点信号spr7;
182、9)向流通池中加入pbs缓冲液,运行10~60min,记录终点信号spr8;
183、10)计算δspr=(spr5-spr8)/(spr5-spr1)的比值。
184、优选地,所述h1的工作浓度为5~15μm;进一步为8~10μm。
185、优选地,所述h2的工作浓度为2~10μm;进一步为3.85~9.09μm。
186、优选地,所述h3的工作浓度为2~7μm;进一步为2.88~5.77μm。
187、优选地,所述cas蛋白的工作浓度为10~4000nm;进一步为80~400nm;更进一步为80~100nm。
188、优选地,所述crrna的工作浓度为10~4000nm;进一步为80~400nm;更进一步为80~100nm。
189、优选地,所述蛋白酶k为500~1500倍稀释后的蛋白酶k(全式金)。
190、优选地,步骤7)中所述crispr反应体系包含检测sars-cov-2保守序列n基因的crispr反应体系、检测sars-cov-2 omicron变异株s基因的crispr反应体系、检测sars-cov-2 delta变异株s基因的crispr反应体系、检测sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的crispr反应体系中的至少一种。
191、优选地,不同的crispr反应体系区别仅在于crrna不同:检测sars-cov-2保守序列n基因的crispr反应体系包含crrna-n,检测sars-cov-2 omicron变异株s基因的crispr反应体系包含crrna-o,检测sars-cov-2 delta变异株s基因的crispr反应体系包含crrna-d,检测sars-cov-2 omicron ba.2变异株s基因的crispr反应体系包含crrna-ba。
192、优选地,不同的crispr反应体系可以置于同一spr分子相互作用仪中通过多通道检测,也可以依次置于同一或不同spr分子相互作用仪依次进行检测。
193、优选地,所述待测核酸包括dna和rna中的至少一种。
194、优选地,所述dna包括ssdna和dsdna中的至少一种;进一步包括dsdna。
195、优选地,所述待测核酸来自动物、植物或微生物样品。
196、优选地,所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
197、优选地,所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
198、优选地,所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
199、优选地,所述待测核酸加入crispr反应体系前还可以包括如下步骤:对所述核酸进行逆转录和/或扩增。
200、本发明的有益效果是:
201、本发明提供了一种试剂盒,包含:spr生物传感器芯片、h1、h2和h3;所述h1的核苷酸序列为n1 n2……nnttattattnn+1 nn+2……nn+m;所述n为a、t、c或g;所述m、n独立选自于:10、11、12、13、14、15、16;所述h2与所述h1的5’端反向互补,所述h3与所述h1的3’端反向互补;或所述h2与所述h1的3’端反向互补,所述h3与所述h1的5’端反向互补;该试剂盒可以与crispr-cas系统联用,针对不同的目标核酸,设计相应的crispr-cas系统(crrna及cas蛋白),实现目标核酸的检测,而无需更换spr生物传感器芯片和报告探针(h1、h2和h3),并且本发明提供的试剂盒形成的双链报告探针可以提高检测的灵敏度。
202、进一步地,本发明通过限定该试剂盒还包含:crrna及cas蛋白;得到基于光子crispr传感方法学(methodologies of photonic crispr sensing,mopcs)的试剂盒,该试剂盒将crispr技术与表面等离子共振技术结合,相比诸如荧光、吸收光谱等传统光学检测手段,该试剂盒的方法具有无法比拟的超高灵敏度;相比测序或荧光显色等检测方法,该试剂盒的方法对样品处理的要求非常简单,不需要复杂的分子标记手段,从而极大简化了检测操作流程,同时降低了认为操作可能引入的检测误差的风险;并且该试剂盒的方法可以实现对检测样本进行长时间的实时监测,从而获得对检测样本各种复杂分子间相互作用的大范围动力学分析数据,进而得到分子间亲和、解离、作用力等更加全面的分析;同时,该试剂盒的方法具有极佳的兼容性,尤其是与微流控技术相结合,可以实现自动化、高通量、高灵敏度的样品检测;并且该试剂盒的方法通过crispr系统(cas蛋白及crrna),通过crrna的向导序列实现高特异性识别,实现目标核酸的精确识别和定量;并且相比常规核酸检测方法,该试剂盒方法灵敏度更高,检测下限最低可达0.3fm。
203、进一步地,本发明提供了一种用于新型冠状病毒基因分型的试剂盒,可以实现新型冠状病毒的检测和/或分型。