一种致敏DC细胞及在肿瘤治疗中的应用的制作方法

一种致敏dc细胞及在肿瘤治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及免疫细胞治疗领域，尤其涉及一种致敏dc细胞及在肿瘤治疗中的应用。


背景技术：

2.树突状细胞(dc细胞)作为一种抗原递呈细胞，是免疫系统的核心参与者，也是先天免疫和获得性免疫反应的重要调节剂，能够诱导免疫系统对病原体的免疫反应，也能对无害抗原建立免疫耐受，同时维持两者之间的平衡，刺激或抑制t细胞反应。
3.研究表明，dc和cik细胞共同培养后，具有比cik细胞更强的抗肿瘤活性，发挥更强的杀伤肿瘤作用，明显提高肿瘤患者的免疫功能，最终有效地抑制肿瘤的生长。dc-cik细胞是肿瘤免疫治疗的重要研究方向。
4.对dc细胞进行致敏可以增强dc细胞的相关特性，并且致敏dc与cik细胞共培养得到的dc-cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力更强。研究发现，多种外源物质可以对dc细胞进行致敏，比如肿瘤细胞的裂解物。但是，肿瘤细胞裂解物致敏dc可能引发不可预知的副作用。因此，寻找更多的dc致敏物质具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种致敏dc细胞及在肿瘤治疗中的应用。
6.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
7.一种dc细胞，该dc细胞经氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2在体外诱导培养得到。具体实施例表明，氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2在体外诱导培养得到致敏dc细胞具有更强的迁移能力，且与cik细胞共培养获得的dc-cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力更强。
8.上述经氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2在体外诱导培养得到的dc细胞在与cik细胞体外共培养制备对肿瘤细胞杀伤力增强的dc-cik细胞中的应用，所述肿瘤优选为肺癌。具体实施例表明，氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2在体外诱导培养的致敏dc细胞与cik细胞共培养获得的dc-cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力更强。
9.上述dc细胞或dc-cik细胞在制备治疗肿瘤的生物制剂中的应用。
10.氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2在dc细胞体外培养增强dc细胞迁移能力中的应用。具体实施例表明，氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2在体外诱导培养得到致敏dc细胞具有更强的迁移能力，这可能和其与cik细胞共培养获得的dc-cik细胞对肿瘤细胞杀伤力更强有关。
11.本发明发现，氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2对dc细胞具有致敏作用，可以显著提高dc细胞的迁移能力；该多肽致敏获得的致敏dc细胞与cik细胞共培养获得的dc-cik细胞对肿瘤细胞具有更强的杀伤力。
附图说明
12.图1是各组dc细胞的迁移结果。
13.图2是各组dc-cik细胞对肺癌a549细胞的杀伤力。
具体实施方式
14.一、实验材料
15.人外周血单个核细胞(pbmc)购自武汉赛奥斯生物科技有限公司，a549细胞购自atcc。
16.syntide 2购自源叶，cas号108334-68-5，氨基酸序列plartlsvaglpgkk，纯度96％。
17.fbs、rpmi 1640培养基购自gibco。
18.重组gm-csf、il-4、tnf-α、ifn-γ、il-2、il-1α和抗人cd3单抗购自碧云天生物。
19.transwell小室购自购自康宁/corning正品。
20.二、实验方法
21.1、dc细胞和cik细胞诱导培养
22.取生长状态良好的pbmc细胞以5
×
106/ml的密度接种至含10％fbs的rpmi 1640培养基中于37℃、5％co2培养箱培养4h，分别收集贴壁细胞和非贴壁细胞，前者用于诱导培养dc细胞，后者用于诱导培养cik细胞。
23.诱导培养dc细胞的具体方法为：将贴壁细胞以1
×
106/ml的密度接种至含1000u/ml gm-csf、500u/ml il-4和10％fbs的rpmi 1640培养基中于37℃、5％co2培养箱培养，每3d更换一次含有上述细胞因子和fbs的rpmi 1640培养基，第6d时：常规组向培养基中加入1000u/mltnf-α，syntide 2致敏ⅰ组向培养基中加入1000u/mltnf-α和40μg/ml syntide2，syntide 2致敏ⅱ组向培养基中加入1000u/mltnf-α和80μg/ml syntide 2，继续培养3d。
24.诱导培养cik细胞的具体方法为：将非贴壁细胞以1
×
106/ml的密度接种至含1000u/ml ifn-γ和10％fbs的rpmi 1640培养基中于37℃、5％co2培养箱培养，24h后加入50ng/ml抗人cd3单抗、500u/ml il-2和l00u/ml il-1α，每3d更换一次含有上述细胞因子和fbs的rpmi 1640培养基，继续培养9d。
25.2、dc细胞迁移能力测定
26.按transwell小室测定细胞迁移能力的操作手册进行，具体如下：分别取常规组、syntide2致敏ⅰ组和syntide 2致敏ⅱ组dc细胞，消化，用rpmi 1640培养基重悬制成浓度为5
×
105/ml的细胞悬液，接种于24孔transwell小室的上室中，每孔接种200μl；transwell小室的下室按每孔600μl加入含10％fbs的rpmi 1640培养基；于37℃、5％co2培养箱培养24h后，分别取出小室并小心弃去培养基，用无菌棉签将上室未迁移的细胞拭去，用多聚甲醛对下室细胞固定，pbs洗涤2～3次，结晶紫染液染色，显微镜下观察各组迁移细胞数目。
27.3、dc-cik细胞共培养
28.将上述常规组、syntide 2致敏ⅰ组和syntide 2致敏ⅱ组dc细胞与cik细胞消化并用含10％fbs的rpmi 1640培养基重悬后按照dc细胞：cik细胞＝1：10的数量比例于37℃、5％co2培养箱混合培养72h，得常规组、syntide 2致敏ⅰ组和syntide 2致敏ⅱ组dc-cik细胞。
29.4、对肿瘤细胞杀伤力测定
30.将肺癌a549细胞复苏后用含10％fbs的rpmi 1640培养基培养，取对数期a549细胞作为靶细胞。以上述dc-cik细胞为效应细胞。分别取靶细胞、效应细胞按2
×
104/孔、2
×
105/孔接种于96孔板中，每种细胞接种100μl，每组5个复孔。同时设置单独的效应细胞组和靶细胞组。将靶细胞和效应细胞按照上述方法混合后于37℃、5％co2培养箱混合培养24h，于每个培养孔中加cck-8试剂20μl，然后于37℃、5％co2培养箱继续培养4h，取出用酶标仪测定各孔的od
450nm
吸光度值，按照公式计算各组dc-cik细胞对a549细胞的杀伤力。
31.杀伤力(％)＝[1-(效靶组od
450nm-效应细胞组od
450nm
)/靶细胞组od
450nm
]
×
l00％。
[0032]
5、统计学分析
[0033]
采用spss 19.0统计软件进行分析，用均数
±
标准差表示，组间比较采用t检验，p《0.05代表差异具有统计学意义。
[0034]
三、实验结果
[0035]
1、dc细胞迁移能力
[0036]
dc细胞的迁移能力与其发挥生物学功能具有重要关联。transwell小室测定结果如图1所示，从该结果可以很明显地发现：与常规组相比，syntide 2致敏ⅰ组的dc细胞具有更强的迁移能力(*，p《0.05)；与常规组相比，syntide 2致敏ⅱ组的dc细胞具有更强的迁移能力(*，p《0.05)。该结果说明，多肽syntide 2可以有效增强dc细胞的迁移能力，并且呈现明显的剂量依赖效应。这有助于提高dc细胞的生物学功能。
[0037]
2、对肿瘤细胞杀伤力
[0038]
各组dc-cik细胞对a549细胞的杀伤力如表1和图2所示，syntide 2致敏ⅰ组和syntide2致敏ⅱ组dc-cik细胞对a549细胞的杀伤力明显强于常规组dc-cik细胞。这可能与syntide2提高了dc细胞的迁移活性进而增强了dc-cik细胞之前的信号传递有关。
[0039]
表1 dc-cik细胞对a549细胞的杀伤力
[0040]
组别杀伤力(％)常规组37.55
±
4.18syntide2致敏ⅰ组49.26
±
3.97syntide2致敏ⅱ组70.82
±
4.54
[0041]
从以上实施例可以看出，氨基酸序列为plartlsvaglpgkk的多肽syntide 2对dc细胞具有致敏作用，可以显著提高dc细胞的迁移能力；该多肽致敏获得的致敏dc细胞与cik细胞共培养获得的dc-cik细胞对肿瘤细胞具有更强的杀伤力，这可能与syntide 2提高了dc细胞的迁移活性进而增强了dc-cik细胞之前的信号传递有关。