天冬氨酸激酶突变体及其在生产L-高丝氨酸中的应用

天冬氨酸激酶突变体及其在生产l-高丝氨酸中的应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体公开酶活提高的天冬氨酸激酶突变体及其在制备l-高丝氨酸或其衍生物中的应用。


背景技术：

2.l-高丝氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，也是甲硫氨酸、赖氨酸和苏氨酸的前体，参与体内多种生理生化反应和多个生物代谢过程，具有重要的生理功能和应用价值。高丝氨酸及其衍生物具有丰富的生物活性，可作为抗真菌药物，有效的抑制镰状红细胞，衍生物高丝氨酸甲酯是具有抗癌活性化合物chinese bittersweet alkaloid的重要中间体。高丝氨酸还是用来合成新型农药l-草铵膦的主要原料，草铵膦作为内吸传导型除草剂，因其具有广谱除草高活性，现已在国外发达国家得到广泛应用，且需求量逐年递增。由于人们对这些药物的迫切需要，刺激了对关键中间体l-高丝氨酸的大量需求。此外，高丝氨酸在农作物肥料添加剂和畜牧业饲料添加剂中具有潜在的应用前景，例如在雏鸡日粮中，高丝氨酸具有和苏氨酸相似的生物活性，在缺乏苏氨酸情况下，高丝氨酸可以替代苏氨酸改善幼雏的生长性能。同时高丝氨酸为中间体可以转化合成为丙烯酸、3-羟基丙酰-coa、3-羟基丙酸酯、聚-3-羟基丙酸酯和1,2-丙二醇。综上所述，高丝氨酸作为中间体或原料能够合成多种化工产品、农药及饲料，可应用于食品、化妆品、医药和饲料等领域，具有广阔的应用前景。
3.目前，l-高丝氨酸的合成方法主要是化学法和生物酶法。化学法以l-甲硫氨酸或天冬氨酸为原料，需要使用碘化物和大量有机溶剂，并且生成硫化物，伴随着严重的环境和安全问题。生物酶法是以丙酮酸和醛类化合物为原料，在醛缩酶、甲酸脱氢酶和l-氨基酸脱氢酶复合酶的共同催化下反应得到高丝氨酸，成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需要使用价格昂贵的辅酶等。近年来，微生物发酵生产l-高丝氨酸受到越来越多的关注，微生物发酵法提供了一种安全、经济效益高、环境友好的替代生产策略。
4.在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母等微生物中，l-高丝氨酸的生物合成是从天冬氨酸支路途径开始的。葡萄糖经过糖酵解途径、磷酸戊糖途径和tca循环等生成草酰乙酸前体，并进入天冬氨酸支路途径；然后天冬氨酸前体在天冬氨酸激酶（aspartokinase，ec: 2.7.2.4）、天冬氨酸半醛脱氢酶（aspartate-semialdehyde dehydrogenase，ec: 1.2.1.11）和高丝氨酸脱氢酶（homoserine dehydrogenase，ec: 1.1.1.3）等顺次催化下最终生成l-高丝氨酸。其中天冬氨酸激酶是高丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸等天冬氨酸家族氨基酸合成途径中第一个共同关键酶，能够将中心碳代谢流引入天冬氨酸支路，其催化活性常受到末端产物或中间代谢物的反馈抑制或阻遏效应。因此，通过筛选或分子改造天冬氨酸激酶，获得具有优良的催化性能的关键酶突变体，对于天冬氨酸家族氨基酸的高效生产都具有非常重要的意义。


技术实现要素：

5.基于上述需求，本发明的首要目的在于提供天冬氨酸激酶突变体，以使得其催化
性能得到提升，有利于微生物发酵生产l-高丝氨酸等代谢产物。
6.本发明提供一种来源于野生型saccharomyces cerevisiae s288c的天冬氨酸激酶lysc突变体，其特征在于，相对于seq id no.2所示氨基酸序列而言，仅第299位由缬氨酸v突变为丙氨酸a，或者第317位由天冬酰胺n突变为丝氨酸s，或者第485位由天冬酰胺n突变为丝氨酸s中的一个位点突变；仅存在第107位由谷氨酰胺q突变为精氨酸r和第317位由天冬酰胺n突变为丝氨酸s的组合突变；仅存在第114位由苏氨酸t突变为丝氨酸s和第510位由谷氨酰胺q突变为精氨酸r的组合突变；仅存在第155位由苏氨酸t突变为丙氨酸a和第390位由赖氨酸k突变为谷氨酸e的组合突变。
7.本发明进一步提供所述天冬氨酸激酶lysc突变体的编码基因。优选地实施方式中，所述天冬氨酸激酶lysc编码基因的核苷酸序列是在seq id no.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。本发明还提供含有所述的天冬氨酸激酶lysc突变体编码基因的表达载体和宿主细胞。在一个优选实施方式中，所述表达载体包括但不限于pacyc184和pxmj19，通过构建含有所述lysc突变体编码基因的重组质粒，并将其导入微生物底盘细胞中，用于发酵生产l-高丝氨酸及下游衍生物等。所述衍生物通常指的衍生物是指其代谢途径的下游代谢产物，如苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等（如图1）。赖氨酸虽然不是其衍生物，但由于lysc酶位于代谢途径上游，也可由本发明的方法获得。
8.在具体的实施方式中，所述微生物底盘细胞可选自棒杆菌属、肠杆菌属或酵母菌属，优选地是大肠杆菌（escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）和酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）。
9.本发明还提供了天冬氨酸激酶突变体在发酵生产l-高丝氨酸及衍生物中的应用。选用具有一定l-高丝氨酸生产能力的底盘工程菌进行应用性能测试，在一个具体的实施例中，所述工程菌ec-hom特征在于大肠杆菌escherichia coli mg1655中敲除了自身高丝氨酸降解途径基因thrb（proteinid: np_414544）和meta（protein id: np_418437），同时过表达天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶基因thra（protein id: np_414543）；在另外一个具体的实施例中，所述工程菌cg-hom特征在于谷氨酸棒杆菌corynebacterium glutamicum atcc 13032中敲除了自身高丝氨酸降解途径基因thrb（protein id: caf19888），同时过表达高丝氨酸脱氢酶基因hom（protein id: caf19887）。
10.本发明通过以下技术思路实现，以酿酒酵母基因组为模板，利用易错pcr随机突变方法获得lysc编码基因突变文库，采用基于golden gate技术的载体构建策略将其亚克隆至表达载体上，获得含有天冬氨酸激酶lysc突变体编码基因的重组质粒文库。随后将重组质粒文库导入敲除高丝氨酸降解途径的大肠杆菌（已含高丝氨酸生物传感器phombio），通过96孔板初筛和试管、摇瓶复筛，最终筛选获得酶活性提高的突变体，其突变位点分别为v299a、n317s、n485s、q107r/n317s、t114s/q510r和t155a/k390e。
11.本发明有益效果在于，通过对酿酒酵母来源的天冬氨酸激酶编码基因lysc进行突变和筛选，获得了催化活性不同程度提升的天冬氨酸激酶突变体。因此，本发明提供的几种天冬氨酸激酶突变体能够为高效发酵生产l-高丝氨酸及下游其他天冬氨酸家族代谢产物奠定了良好基础，相较于未突变型天冬氨酸激酶具有更好的工业化应用前景。
附图说明
12.图1 微生物l-高丝氨酸生物合成途径示意图。
13.图2 天冬氨酸激酶突变体酶活测定。
14.图3 l-高丝氨酸工程菌产量分析。
具体实施方式
15.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明，但并不应理解为对本发明的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
16.实施例1 天冬氨酸激酶lysc变体文库的构建本发明采用保真性低的easytaq dna聚合酶（beijing transgen biotech, china），以野生型酿酒酵母saccharomyces cerevisiae s288c基因组为模板，利用引物p1 (5
’‑
caccaggtctcagaccatgccaatggatttccaacctacatcaag-3’）和p2（5
’‑
caccaggtctcagatctcagtggtggtggtggtggtgaattc-3’），通过易错pcr方法获得lysc编码基因突变文库。通过在pcr反应体系中加入一定浓度的镁离子和锰离子，进一步降低pcr扩增过程中的保真性，控制获得的lysc编码基因中含有2-3个点突变。本发明采用的易错pcr体系为：5 μl 10
ꢀ×ꢀ
easytaq缓冲液、0.2 μm上游引物p1、0.2 μm上游引物p2、200 μm dntps、0.8 mm mncl2、6 mm mgso4、50 ng模板dna、1 μl easytaq dna聚合酶，加入无菌水补齐至50 μl体系。pcr反应程序为：95℃ 预变性3 min；95℃变性30 s；58℃退火30s；72℃延伸2 min，循环35次；72℃ 延伸 5min，4℃保存。
17.采用高保真性的phusion high-fidelity dna 聚合酶，以pacyc184质粒为模板，利用引物p3（5
’‑
caccaggtctcagatccggctgctaacaaagcc-3’）和p4（5
’‑
caccaggtctcaggtctgtttcctgtgtgaaattgttatccg-3’），通过普通pcr方法获得pacyc质粒骨架。10 μl 5
ꢀ×ꢀ
phusion hf缓冲液、0.5 μm上游引物p1、0.5 μm上游引物p2，200 μm dntps、3% dmso、50 ng模板dna、0.5 μl phusion high-fidelity dna聚合酶 (thermo scientific, usa)，加入无菌的水补齐至50 μl体系。pcr反应程序为：98℃预变性1 min；98℃变性10 s；62℃退火20s；72℃延伸3 min，循环35次；72℃ 延伸 5 min，4℃保存。
18.基于goldengate方法将pcr获得的lysc编码基因突变文库和pacyc184质粒骨架进行连接，获得含有lysc编码基因不同突变体的重组表达质粒pacyc184-lysc
mut
。goldengate 连接体系为：t4 dna ligase buffer 1.5 μl，t4 dna ligase 1 μl，bsai 1 μl，10
×
bsa 1.5μl，质粒骨架、片段（摩尔比为1:1，共10μl），总体积为15μl。pcr连接条件：37℃ 3min， 22℃ 4 min（40个循环）；22℃ 30min；80℃5min；4℃ 10 min。然后将上述连接体系按照常规的大肠杆菌热激转化法，导入大肠杆菌dh5α感受态细胞，获得的重组质粒文库。
19.实施例2 天冬氨酸激酶lysc变体文库的筛选鉴定本发明通过高丝氨酸生物传感器建立筛选方法用于筛选天冬氨酸激酶lysc突变体，所述高丝氨酸生物传感器phombio已经在本技术人前述专利申请（申请号 202110059860.2）中公开，其是基于谷氨酸棒状杆菌转录调节因子ncgl0581构建的，含有ncgl0581开放阅读框和ncgl0580启动子的基因组区域被克隆在gfp的前面，使得gfp的表达
受ncgl0580启动子的控制。利用该生物传感器能够将l-高丝氨酸浓度与荧光信号强度联系起来，使l-高丝氨酸浓度水平可视化，实现对目标产物l-高丝氨酸的灵敏检测。
20.高丝氨酸生物传感器可以响应l-高丝氨酸，随着胞内l-高丝氨酸浓度的增加，荧光强度也随之提高，所以本发明基于l-高丝氨酸生物传感器建立了高通量筛选方法。将实施例1中的重组质粒突变文库和高丝氨酸生物传感器质粒导入已敲除高丝氨酸降解途径的大肠杆菌中，通过流式细胞仪筛选获得荧光强度高的有益突变体。天冬氨酸激酶酶活提高的突变体，其胞内产生的l-高丝氨酸浓度会随之变高，荧光强度也会增强。所述的敲除高丝氨酸降解途径的大肠杆菌是指在e.coli mg1655中敲除meta和thrb，菌株基因型为：
∆
meta
∆
thrb。
21.具体筛选步骤为：先将高丝氨酸生物传感器质粒转入e. coli mg1655
∆
meta
∆
thrb菌株中，然后将其做成感受态，再将转入实施例1中所述重组质粒突变文库，涂布在含有氯霉素和卡那霉素的选择性抗生素琼脂平板上。用灭菌的pbs 溶液洗涤平板上的菌落，接种到含有发酵培养基的摇瓶中，初始od=0.5，30
°
c 200rpm过夜发酵；取1ml发酵液离心，用pbs溶液洗3次，稀释至 od为0.1，流式细胞仪分选，收集荧光强度比对照（野生型）高的突变体于平板上，37℃过夜培养。用灭菌的牙签挑单菌落至含200ullb培养基的96浅孔板，37℃培养约12h，转接至含有600 μl lb培养基的96深孔板中至od=0.6，添加0.4mmiptg，16℃，800rpm 过夜诱导，离心收集菌体，加200 μl的含有3mg/ml溶菌酶的裂解buffer重悬，37℃反应2h, 离心取上清测定酶活；将初筛得到的酶活提高的突变体接至含5ml lb培养基的试管，37℃培养至od=0.6，加0.4mm iptg，16℃过夜诱导，离心收集菌体，超声破碎，离心取上清测定酶活，sanger测序确定突变位点，经过三轮筛选程序，最终获得6个不同的lysc有益突变体，即v299a、n317s、n485s、q107r/n317s、t114s/ q510r和t155a/k390e。
22.所述lb培养基组分包括：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1% nacl。所述发酵培养基组分包括：50 g/l glucose, 2 g/l yeast extract, 2 g/l mgso4·
7h2o, 4 g/l kh2po4, 14 g/l(nh4)2so4, 0.5 g/l methionine, 0.5 g/l threonine, 20 ml 无机盐离子储液，所述无机盐离子储液包括10 g/l feso4·
7h2o, 0.5 g/l mnso4·
4h2o。
23.实施例3天冬氨酸激酶lysc变体的酶活测定基于goldengate方法将pcr获得的lysc编码基因突变片段和pet21b质粒骨架进行连接，获得含有lysc编码基因不同突变体的表达质粒pet21b-lysc
mut
，将该质粒按照常规的大肠杆菌热激转化法导入大肠杆菌bl21感受态细胞中。收集诱导表达的菌体，离心去除培养基，菌体用10 ml预冷的裂解buffer重悬菌体沉淀（20 mm na2hpo3，200 mm nacl，ph 7.5）。使用超声波细胞破碎仪破碎细胞，设定200w功率，超声2 s间歇1 s，超声10 min；随后在高速冷冻离心机上8000
×
g离心10 min，收集上清用于后续蛋白纯化以及酶活性测定。
24.由于天冬氨酸激酶能够催化天冬氨酸生成天冬氨酸磷酸，然后在天冬氨酸半醛脱氢酶的作用下，消耗nadph，还原为天冬氨酸半醛，所以可以根据连续检测nadph在340nm处的吸光度下降计算天冬氨酸激酶的酶活性。反应体系:11.6mm天冬氨酸，70mmatp，5.8mmmgac2，0.60mm nadph，588mmkcl，140mm tris-hcl(ph7.5)，3~5单位的天门冬氨酸半醛脱氢酶，以及适量的天冬氨酸激酶样品。在上述条件下，每分钟催化氧化1 μmol nadph的酶活力为1个酶活单位。
25.通过对天冬氨酸激酶的活性测定分析，如图2所示。结果表明，相较于未突变型天
冬氨酸激酶，绝大多数天冬氨酸激酶lysc突变体都表现出明显增强的酶活性，其中v299a和q107r/n317s突变体的酶活性可达12.49
ꢀ±ꢀ
0.57 μmol/min/mg和13.08
ꢀ±ꢀ
0.13 μmol/min/mg，相较于野生型对照分别提高了3.6和3.8倍，提示其更具有工业化应用前景。
26.实施例4 表达天冬氨酸激酶lysc突变体提高工程菌发酵生产l-高丝氨酸基于实施例3获得的天冬氨酸激酶突变体，构建微生物细胞工厂用于发酵生产l-高丝氨酸及下游衍生产品。本实施例中优选取的质粒为大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌pxmj19穿梭诱导表达型载体，该质粒本身含有强启动子tac相关序列（包括操纵序列laco），当加入iptg或乳糖等诱导物时，会促使阻遏蛋白离开操纵序列从而起始基因表达。基于goldengate方法将pcr获得的lysc编码基因突变片段和pxmj19质粒骨架进行连接，获得含有lysc编码基因不同突变体的表达质粒pxmj19-lysc
mut
。将相应的表达质粒分别转化具有一定l-高丝氨酸生产能力的底盘工程菌进行发酵性能测试。在一个具体的实施例中，所述工程菌ec-hom特征在于大肠杆菌escherichia coli mg1655中敲除了自身高丝氨酸降解途径基因thrb（proteinid: np_414544）和meta（protein id: np_418437），同时过表达天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶基因thra（protein id: np_414543）；在另外一个具体的实施例中，所述工程菌cg-hom特征在于谷氨酸棒杆菌corynebacterium glutamicum atcc 13032中敲除了自身高丝氨酸降解途径基因thrb（protein id: caf19888），同时过表达高丝氨酸脱氢酶基因hom（protein id: caf19887）。
27.将上述获得的工程菌株分别接种至含有20 ml lbhis培养基的三角瓶中，培养16 h至对数中期。离心收集细胞，用新鲜的发酵培养基悬浮，接种至含有25 ml发酵培养基的500 ml三角瓶中，调整起始od
600
为1.0。所述lbhis培养基为：酵母粉5 g/l，蛋白胨10 g/l，氯化钠10 g/l，脑心浸液18.5 g/l，山梨醇91 g/l。所述发酵培养基为：葡萄糖60 g/l，尿素0.5 g/l，玉米浆 30 g/l，硫酸铵 20 g/l，kh2po
4 5 g/l，mgso4·
7h2o 5 g/l，feso4·
7h2o 0.2 g/l，mncl2·
4h2o 0.1 g/l，生物素0.2 mg/l，维生素混合液 10 mg/l，以及caco
3 10 g/l用于发酵培养基的缓冲剂。种子培养基包括20 g/l葡萄糖，尿素0.2 g/l，玉米浆 15 g/l，硫酸铵 20 g/l。
28.将上述获得的工程菌株分别接种至含有20~25 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，培养12h~16 h至对数中期。然后离心收集细胞，用新鲜的发酵培养基悬浮，接种至含有50 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，起始od
600
为0.8~1.2，并加入5~15 g/l caco3。发酵条件为30
ꢀº
c，150~200 rpm，恒温振荡培养。发酵培养基为：葡萄糖50~60 g/l，尿素0.1~0.2 g/l，玉米浆 5~10 g/l，硫酸铵 15~20 g/l，kh2po
4 5~6 g/l，mgso4·
7h2o 2 ~5 g/l，feso4·
7h2o 0.2~0.5 g/l，mncl2·
4h2o 0.2~0.4 g/l，生物素0.2~0.4 mg/l，维生素b1 1~2 mg/l，维生素b6 1~2 mg/l，caco
3 5~15 g/l用于发酵培养基的缓冲剂。种子培养基包括10~20 g/l葡萄糖，尿素0.1~0.2 g/l，玉米浆 15~20 g/l，硫酸铵 15~20 g/l，iptg添加浓度0.2 mm。研究结果表1所示：表1 天冬氨酸激酶lysc突变体表达对于底盘工程菌发酵生产l-高丝氨酸的影响
经过72 h发酵培养后，在大肠杆菌ec-hom工程菌中过表达上述天冬氨酸激酶lysc突变体后，能够将对照出发菌的l-高丝氨酸产量提高80%-285%； 在谷氨酸棒杆菌cg-hom工程菌中过表达上述天冬氨酸激酶lysc突变体后，能够将对照出发菌的l-高丝氨酸产量提高5%-49%。相较于未突变型天冬氨酸激酶，在底盘工程菌中表达上述天冬氨酸激酶lysc突变体可以明显提升菌株发酵生产l-高丝氨酸的能力。