1.本发明涉及植物蛋白及微量元素深加工技术领域，具体涉及一种生物硒活性肽及其制备方法和用途。
背景技术：
2.硒是动物和人体中一些抗氧化酶和硒蛋白p的重要组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围的作用，研究证明具有提高肌体免疫力作用，也是国际上免疫力影响和癌症预防的研究热点，因此，硒可作为动物饲料微量添加剂，也在植物肥料中添加微量元素肥，提高农副产品含硒量。硒已被作为人体必需的微量元素。科学家测定：有些疾病，特别是肿瘤、高血压、内分泌代谢病、糖尿病、老年性便秘都与缺硒有关。硒被国内外医药界和营养学界尊称为“生命的火种”，享有“长寿元素”、“抗癌之王”、“心脏守护神”、“天然解毒剂”等美誉。硒在人体组织内含量为千万分之一，但它却决定了生命的存在，对人类健康的巨大作用是其他物质无法替代的。缺硒会直接导致人体免疫能力下降，临床医学证明，威胁人类健康和生命的四十多种疾病都与人体缺硒有关，如癌症、心血管病、肝病、白内障、胰脏疾病、糖尿病、生殖系统疾病等等。据专家考证，人需要终生补硒。
3.成人体内硒的总量在6-20 mg。硒遍布各组织器官和体液，肾中浓度最高。在组织内主要以硒和蛋白质结合的复合物形式存在。硒主要在小肠吸收，人体对食物中硒的吸收率为60%-80%。经肠道吸收进入体内的硒经代谢后大部分经尿排出。尿硒是判断人体内硒盈亏状况的良好指标。硒的其他排出途径为粪、汗。硒在体内的吸收、转运、排出、贮存和分布会受许多外界因素的影响，性别、年龄、健康状况，以及食物中是否存在如硫、重金属、维生素等化合物也有影响。动物实验表明，硒主要在十二指肠被吸收，空肠和回肠也稍有吸收，胃不吸收。经尿排出的硒占硒排出量的50%-60%，在摄入高膳食硒时，尿硒排出量会增加，反之减少，肾脏起着调节作用。
技术实现要素：
4.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种人体容易吸收利用、无副作用的生物硒活性肽及其制备方法和用途。
5.一种生物硒活性肽的制备方法，包括如下步骤：（1）、将富硒植物种子加入水中浸泡，然后取出富硒植物种子，然后每天喷水2-3次进行发芽，待发芽6-7天后出料，得到种子发芽原料，然后搅碎得到浆液；（2）、酶解：向所述浆液中依次加入种子发芽原料重量的0.5-0.8%的淀粉酶、1-1.5%的碱性蛋白酶和0.5-0.8%的氨基肽酶，相邻两种酶添加的时间间隔为0.4-0.6h，搅拌酶解，最后一种酶添加结束后，继续搅拌酶解3-3.5h；搅拌酶解的温度保持55-57℃；（3）、灭酶；（4）、固液分离；（5）、将步骤（4）得到的分离液先用0.8-1.2nm的纳滤膜进行过滤，留取透过液，再
用0.2-0.3nm的纳滤膜过滤，留取膜截留液；（6）、将步骤（5）得到的膜截留液加入有机硒，进行肽硒螯合；（7）、将步骤（6）中得到的螯合液进行浓缩、干燥。
6.可选的，将富硒植物种子加入富硒植物种子重量5-6倍的纯化水中，浸泡12-18h；和/或所述发芽的温度为15-20℃，湿度为65-70%。
7.可选的，所述淀粉酶的酶活为17-23u/mg；所述碱性蛋白酶的酶活为25-31u/mg；所述氨基肽酶的酶活为22-28u/mg。
8.可选的，步骤（3）中，将步骤（2）得到的酶解液升温至90-95℃，保持10-15min灭酶。
9.可选的，步骤（4）中，所述固液分离步骤中，先用卧螺离心机过滤除去固形物，再用板框过滤机过滤，最后用三相离心机离心纯化；卧螺离心机转速为3600转/分；板框过滤机中滤板孔径为0.3-0.4μm；三相离心机的转速为18000转/分。
10.可选的，所述步骤（6）中，有机硒的添加量为加入种子发芽原料重量的0.06-0.07
‰
。
11.可选的，所述步骤（6）中，所述肽硒螯合的条件为：温度45-50℃，搅拌30-45min，搅拌速度为36-45r/min。
12.一种生物硒活性肽的制备方法制备得到的生物硒活性肽，所述生物硒活性肽的肽分子中，相对分子量≤1000道尔顿的肽分子占总肽分子的质量百分比为98%以上，所述生物硒活性肽中肽分子含量为95wt%以上。
13.可选的，所述生物硒活性肽中，二肽和三肽的总含量占总肽分子含量的百分比为＞45wt%。
14.一种生物硒活性肽的制备方法制备得到的生物硒活性肽或所述的生物硒活性肽在制备饲料添加剂、营养配方食品、保健品、特医食品或药品中的用途。
15.本发明技术方案，具有如下优点：1、本发明提供的一种生物硒活性肽的制备方法，通过对浸泡后的富硒种子进行发芽，实现生物转化，可提高生物硒活性肽收率，尤其是可以显著提高产品中二肽和三肽的含量；然后通过选择淀粉酶、碱性蛋白酶和氨基肽酶的组合，可以将种子发芽搅碎后浆液中的蛋白酶解成的小肽分子，同时控制酶加入的顺序以及添加的间隔时间，一方面，避免淀粉酶、碱性蛋白酶和氨基肽酶中的某种酶干扰其他的某种酶，影响部分酶发挥作用，而采用本发明的方法，可以大大提高酶解效率，使得最终制备的生物硒活性肽中，相对分子量在1000道尔顿以下的肽含量达到98wt%以上，进而使获得的生物硒活性肽溶于水，小肽分子可以快速把硒元素输送到细胞内参与生命运动，极大的提高了吸收率和利用率；另一方面，可以避免部分酶的酶解过度将小肽分子酶解成单个氨基酸，而采用本发明的方法，可以极大的降低小肽分子中单个氨基酸的含量，以避免由于单个氨基酸无法螯合有机硒，造成生物硒活性肽中硒元素含量低以及降低小肽分子收率。因此，本发明的获得的小肽分子是完全蛋白活性肽，与其他螯合物相比，对硒元素具有更好的螯合性，有利于螯合游离硒，提高对硒元
素的利用率；进一步的，采用纳滤膜过滤，可以控制产品分子量，提高吸收率；此外，植物来源的生物硒活性肽对肌体无副作用，制备过程中以及制备的生物硒活性肽也无毒副作用物质。
16.2、本发明提供的一种生物硒活性肽的制备方法，所述的碱性蛋白酶和氨基肽酶，能使产品分子量更小，氨基肽酶能选择性切除疏水性氨基酸残基，去掉肽键两端的苦味基团，不但使产品口感更好，而且可以使得料液中小肽分子和硒更容易螯合。所述的淀粉酶，能降解植物蛋白中的淀粉，有利于降解蛋白。
17.3、本发明提供的一种生物硒活性肽的制备方法，在固液分离步骤中，先采用卧螺离心机过滤除去固形物，再用板框过滤机过滤，最后用三相离心机离心纯化，可以去除酶解液中的不溶物，解决了后续的纳滤步骤中过滤难的问题。
18.4、本发明提供的一种生物硒活性肽，所述生物硒活性肽的肽分子中，相对分子量≤1000道尔顿的肽分子占总肽分子的质量百分比为98%以上，所述生物硒活性肽中肽分子含量为95wt%以上，所述的生物硒活性肽的分子结构更接近于硒在生物体中存在的天然形态，不但被肠道直接吸收利用，而且能透过胎盘，增加硒储备，肌体对其吸收率高，无副作用，可以广泛应用于饲料添加剂、营养配方食品、保健品、特医食品或药品中的用途。
具体实施方式
19.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
20.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
21.碱性蛋白酶为内切酶；氨基肽酶为外切蛋白酶，由米曲酶发酵得到。淀粉酶、碱性蛋白酶和氨基肽酶均可市售购买得到。本发明方法中使用的淀粉酶、碱性蛋白酶、氨基肽酶酶活分别为：20u/mg、28u/mg、25u/mg；卧螺离心机、三相离心机、纳滤膜分离装置为通用装置。下述实施例中的有机硒为市售产品。
22.实施例1一种生物硒活性肽的制备方法，包括如下步骤：（1）、将富硒植物种子（富硒小麦）加入富硒植物种子重量5倍的纯化水中浸泡18h，然后取出，每天喷洒水2次进行发芽，发芽的温度为20℃，湿度为65%，待发芽7天后出料，得到发芽原料，然后搅碎得到发芽浆；（2）、酶解：向所述发芽浆中依次加入发芽原料重量的0.8%的淀粉酶，发芽原料重量1.5%的碱性蛋白酶，和发芽原料重量0.8%的氨基肽酶，相邻两种酶添加的时间间隔为0.6h，搅拌酶解，最后一种酶添加结束后，继续搅拌酶解3.5h；搅拌酶解的温度保持57℃；（3）、灭酶：将步骤（2）得到的酶解液升温至95℃，保持10min灭酶；（4）、固液分离：将步骤（3）得到的灭酶液先用卧螺离心机（转速为3600转/分）过滤
除去固形物，再用板框过滤机过滤，最后用三相离心机离心纯化；板框过滤机中滤板孔径为0.3μm；三相离心机的转速为18000转/分；（5）、将步骤（4）得到的分离液先用0.8nm的纳滤膜进行过滤，留取透过液，再用0.2nm的纳滤膜过滤，留取膜截留液；（6）、将步骤（5）得到的膜截留液中加入有机硒，然后升温至温度45℃，搅拌45min，搅拌速度为36r/min；有机硒的添加量为加入发芽原料重量的0.06
‰
；（7）将步骤（6）得到的螯合液用双效浓缩器浓缩，浓缩液喷雾干燥，即得生物硒活性肽产品。
23.实施例2一种生物硒活性肽的制备方法，包括如下步骤：（1）、将富硒小麦加入富硒小麦重量5.5倍的纯化水中浸泡16h，然后取出，然后每天喷洒水2次进行发芽，发芽的温度为17℃，湿度为67%，待发芽7天后出料，得到发芽原料，然后搅碎得到发芽浆；（2）、酶解：向所述发芽浆中依次加入是发芽原料重量的0.6%的淀粉酶、1.3%的碱性蛋白酶和0.6%的氨基肽酶，相邻两种酶添加的时间间隔为0.5h，搅拌酶解，最后一种酶添加结束后，继续搅拌酶解3.5h；搅拌酶解的温度保持56℃；（3）、灭酶：将步骤（2）得到的酶解液升温至93℃，保持13min灭酶；（4）、固液分离：将步骤（3）得到的灭酶液先用卧螺离心机（转速为3600转/分）过滤除去固形物，再用板框过滤机过滤，最后用三相离心机离心纯化；板框过滤机中滤板孔径为0.3μm；三相离心机的转速为18000转/分；（5）、将步骤（4）得到的分离液先用1.0nm的纳滤膜进行过滤，留取透过液，再用0.2nm的纳滤膜过滤，留取膜截留液；（6）、将步骤（5）得到的膜截留液加入有机硒，然后升温至温度48℃，搅拌37min，搅拌速度为40r/min；有机硒的添加量为加入发芽原料重量的0.065
‰
；（7）将步骤（6）得到的螯合液用双效浓缩器浓缩，浓缩液喷雾干燥，即得生物硒活性肽产品。
24.实施例3一种生物硒活性肽的制备方法，包括如下步骤：（1）、将富硒小麦加入富硒小麦重量6倍的纯化水中浸泡12h，然后取出，然后每天喷洒水3次进行发芽，发芽的温度为15℃，湿度为70%，待发芽6天后出料，得到发芽原料，然后搅碎得到发芽浆；（2）、酶解：向所述发芽浆料液中依次加入发芽原料重量的0.5%的淀粉酶、1%的碱性蛋白酶和0.5%的氨基肽酶，相邻两种酶添加的时间间隔为0.4h，搅拌酶解，最后一种酶添加结束后，继续搅拌酶解3h；搅拌酶解的温度保持55℃；（3）、灭酶：将步骤（2）得到的酶解液升温至90℃，保持15min灭酶；（4）、固液分离：将步骤（3）得到的灭酶液先用卧螺离心机（转速为3600转/分）过滤除去固形物，再用板框过滤机过滤，最后用三相离心机离心纯化；板框过滤机中滤板孔径为0.4μm；三相离心机的转速为18000转/分；（5）、将步骤（4）得到的分离液先用1.2nm的纳滤膜进行过滤，留取透过液，再用
0.3nm的纳滤膜过滤，留取膜截留液；（6）、将步骤（5）得到的膜截留液加入有机硒，然后升温至温度50℃，搅拌30min，搅拌速度为45r/min；有机硒的添加量为加入发芽原料重量的0.07
‰
；（7）将步骤（6）得到的螯合液用双效浓缩器浓缩，浓缩液喷雾干燥，即得生物硒活性肽产品。
25.对比例1本对比例与实施例1的区别为，在酶解步骤中，同时加入淀粉酶、碱性蛋白酶和氨基肽酶，上述酶的加入量与实施例1的相同，总的酶解时间与实施例1相同，酶解的温度和搅拌速度与实施例1相同。
26.对比例2本对比例与实施例1的区别为，在步骤（1）中，将富硒小麦粉碎，过80目筛，然后加入富硒小麦重量的3倍纯化水，得到浆液，将得到的浆液用于后续酶解步骤。在酶解步骤中，向所述浆液中依次加入富硒小麦重量的0.8%的淀粉酶，富硒小麦重量1.5%的碱性蛋白酶，和富硒小麦重量0.8%的氨基肽酶，相邻两种酶添加的时间间隔为0.6h，搅拌酶解，最后一种酶添加结束后，继续搅拌酶解3.5h；搅拌酶解的温度保持57℃。
27.实验例1、小肽分子量分布测定（1）、分别取实施例和对比例中固液分离后，开始纳滤过滤前的分离液干燥，然后进行小肽分子量分布测定，结果见下表。
28.表1、小肽分子量分布 分子量≤1000道尔顿的肽分子占总肽分子含量的百分比（wt%）二肽和三肽的总含量占总肽分子含量（wt%）单个氨基酸的总含量占总肽分子含量（wt%）实施例192.456.47.2实施例293.555.86.3实施例391.857.07.5对比例177.915.422.0对比例290.042.810.0
（2）、分别取实施例和对比例中最终制备的生物硒活性肽进行小肽分子量分布测定，测定结果如下表。
29.表2、小肽分子量分布 分子量≤1000道尔顿的肽分子占总肽分子含量的百分比（wt%）二肽和三肽的总含量占总肽分子含量（wt%）单个氨基酸的总含量占总肽分子含量（wt%）生物硒活性肽中肽分子含量（wt%）实施例199.376.70.699.9实施例299.677.70.399.8实施例398.976.60.999.6对比例185.225.413.053.4
对比例298.462.41.790.1
由上述可以看出，本发明制备的生物硒活性肽中二肽和三肽的含量百分比高，单个氨基酸含量低，相比较而言，对比例1的制备的生物硒活性肽中二肽和三肽的含量百分比很低，单个氨基酸含量较高，为获得二肽和三肽的含量百分比更高的生物硒活性肽，需要经过多道过滤步骤才有可能达到，工艺复杂，周期长，成本高。对比例2的制备的生物硒活性肽中二肽和三肽的含量百分比相比本发明的制备的生物硒活性肽中二肽和三肽的含量百分比较低。
30.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。