一种基于DCPO的含磷荧光标记材料及其制备方法和应用与流程

一种基于dcpo的含磷荧光标记材料及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于荧光探针领域，特别涉及一种基于dcpo的含磷荧光标记材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.六氯环三磷腈(n3p3cl6，hccp)是一种经典的含磷杂环化合物，其上的氯原子可通过选择性的亲核取代进行功能化，生成各种磷衍生物，广泛应用于各个领域。随着荧光技术的不断发展，环三聚磷腈环已发展成为一种通用的功能化磷平台，可以用多种功能衍生物制备用于荧光检测和成像领域。
3.荧光分析法广泛应用于生物医学领域，有机分子荧光标记标记材料是细胞和活体荧光成像分析的重要工具。然而传统有机小分子荧光探针仍然存在发射波长短、stokes位移小、易光漂白等缺点，导致传统探针成像应用时存在信背比低和严重的荧光自猝灭现象，限制了其在生物成像分析中的应用。而生物组织在近红外区域的自吸收和自发荧光都显著减弱，因此，近红外荧光成像技术具有更强的组织穿透能力、低的背景荧光干扰及较低的光毒性。但经典近红外荧光染料存在种类不多、合成困难、光和化学稳定性有限以及缺少合适调控基团等问题，限制了其在近红外成像探针构建中的应用。
4.本发明尝试二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚(dcpo)引入到六氯环三磷腈骨架之后，构建了出近红外荧光发射波长，容易透过生物组织，可以用于活体荧光成像的基于dcpo的含磷荧光标记材料，目前未见相关技术公开报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于：提供一种基于dcpo的含磷荧光标记材料及其制备方法和应用，旨在解决经典近红外荧光染料存在光和化学稳定性有限以及缺少合适调控基团等问题，以及合成的hccp-dcpo近红外染料应用于生物体内，作为荧光标记、定位或者成像的功能材料。
6.本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：
7.一种基于dcpo的含磷荧光标记材料，具有如式i所示的结构，名称为二(二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚)二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈(简称为hccp-dcpo)：
[0008][0009]
用于制备上述的基于dcpo的含磷荧光标记材料的中间体，为式(ii)所示的化合物：
[0010][0011]
式(i)基于dcpo的含磷荧光标记材料的合成路线通式如下：
[0012][0013]
制备方法，包括以下步骤：
[0014]
(1)六氯环三磷腈与联苯二酚在催化剂条件下生成二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈；
[0015]
(2)将化合物二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈(hccp-2cl)与二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚(dcpo)在保护气氛、催化剂反应下，加热回流至反应完全。
[0016]
步骤(1)反应条件为：在氮气气氛和-5～0℃下，将溶解在有机溶剂的六氯环三磷
腈加入到溶解在有机溶剂的联苯二酚中，加入催化剂，室温反应，直至六氯环三磷腈反应完全。
[0017]
步骤(2)反应条件为：在氮气气氛和-5-0℃条件下，在催化剂中，加入溶解于有机溶剂的二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚，搅拌15-30min，再加入溶解于有机溶剂的二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈，60-65℃下反应10-16h，直至中间体二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈反应完成。
[0018]
步骤(1)中，所述有机溶剂为thf，所述催化剂为碳酸铯。
[0019]
步骤(2)中，所述有机溶剂为thf，所述催化剂为nah。
[0020]
步骤(1)中，二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈与二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚的摩尔比为:0.52～1:1.15～2，进一步的，二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈与二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚的摩尔比为0.52:1.15。
[0021]
一种用于在生物体内荧光标记、定位或成像的荧光探针，包含上述基于dcpo的含磷荧光标记材料。
[0022]
上述基于dcpo的含磷荧光标记材料或上述荧光探针用于制备在生物体内，作为荧光标记、定位或成像的功能材料方面的应用。
[0023]
本发明的有益效果是：本发明将具有近红外荧光发射波长的荧光团dcpo引入到hccp平台，制备得到产率高，原料来源广泛，成本低廉并且稳定性好的含磷荧光材料，该荧光材料因dcpo接枝在六氯环三磷腈上，活性端被修饰，其裸露的酚羟基就被封闭起来，不易受到外界环境的影响，使得材料的化学性质稳定；
[0024]
hccp-dcpo嫁接了两个dcpo染料以后，细胞毒性降低，具有更高的生物安全性；
[0025]
随着时间的延长，hccp-dcpo光信号衰减慢，因此hccp-dcpo具有较为理想的细胞相容性，可以作为潜在的细胞荧光标记材料；
[0026]
同时由于dcpo具有近红外荧光发射波长，所以容易透过生物组织，可以用于活体荧光成像，同时，近红外光的波长在700～900nm之间，生物体内组织对此波段的光吸收和散射较低，因此，该材料可以应用于生物体内，作为荧光标记、定位或者成像的功能材料，具有良好的开发使用前景。
附图说明
[0027]
图1为对比例1中dcm的核磁氢谱图；
[0028]
图2为对比例1中dcm的核磁碳谱图；
[0029]
图3为对比例1中dcm的核磁质谱图；
[0030]
图4为对比例1中dcpo的核磁氢谱图；
[0031]
图5为对比例1中dcpo的核磁碳谱图；
[0032]
图6为对比例1中dcpo的核磁质谱图；
[0033]
图7为对比例1中hccp的核磁磷谱图；
[0034]
图8为实施例1中hccp-2cl的核磁氢谱图；
[0035]
图9为实施例1中hccp-2cl的核磁碳谱图；
[0036]
图10为实施例1中hccp-2cl的核磁磷谱图；
[0037]
图11为实施例1中hccp-dcpo的核磁氢谱图；
[0038]
图12为实施例1中hccp-dcpo的核磁碳谱图；
[0039]
图13为实施例1中hccp-dcpo的核磁磷谱图；
[0040]
图14为实施例1中hccp-dcpo的核磁质谱图；
[0041]
图15为实施例2中dcpo和hccp-dcpo的荧光光谱图；
[0042]
图16为实施例2中hccp-dcpo和dcpo随时间变化的荧光强度；
[0043]
图17为实施例3中hccp-dcpo体外细胞相容性分析图。
具体实施方式
[0044]
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示和实施例，进一步阐述本发明。
[0045]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0046]
本发明中制备荧光探针(以下称为hccp-dcpo)的过程中所使用的化学试剂、溶剂、均购自探索试剂公司，金属离子等均购自阿拉丁试剂公司。性能测试过程采用bruker公司dtx-400型核磁共振谱仪，溶剂为氘代二甲亚砜(氘代dmso)和氘代氯仿(cdcl3)，以tms为内标记录核磁共振氢谱和碳谱；采用thermo公司的q-exactive hr-ms质谱仪记录高分辨质谱数据。采用英国爱丁堡fs-5荧光分析仪记录荧光光谱，采用tecan公司的spark10m多功能酶标仪记录每个孔中的溶液在450nm处的吸光度值。
[0047]
实施例1二(二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚)二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈(hccp-dcpo)的制备
[0048]
其合成路线如下：
[0049]
[0050]
(1)中间体二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈(hccp-2cl)的制备
[0051]
将无水碳酸铯(2.34g，7.19mmol)置于反应瓶中,在抽真空后，插入氮气球保护，冰浴(-5-0℃)条件下，加入六氯环三磷腈(500.00mg，1.44mmol)的四氢呋喃溶液(35ml)，搅拌15分钟后，再加入联苯二酚(589.20mg，3.16mmol)的四氢呋喃溶液(35ml)，移除冰浴，室温反应，直至hccp的磷信号消失，停止反应，通过离心分离反应液中的盐类，弃去盐类，浓缩上清液，得到固体，采用溶剂为体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的洗脱剂，柱层析进行纯化，得到白色晶体，为中间体二氯二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈，即hccp-2cl，其产量为760mg，其产率为92.0％。
[0052]
中间体hccp-2cl的核磁结果如图8-10所示。
[0053]
1h nmr(400mhz,cdcl3):δ/ppm,7.58-7.37(m,16h).
[0054]
13c nmr(101mhz,dmso-d6)δ/ppm 147.80,129.85,128.59,126.48,121.83.
[0055]
31p nmr(162mhz,cdcl3):δ/ppm,29.22(t,1p),19.48(d,2p),ab
2 system,j＝80hz.
[0056]
(2)二(二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚)二(2,2-二羟基联苯)-环三磷腈(hccp-dcpo)的制备
[0057]
首先向三口烧瓶中加入nah(46mg,1.15mmol)，然后抽真空，插氮气球保护，放在冰浴温度中。称取hccp-2cl(300mg,0.52mmol)溶解在无水thf(35ml)中，用注射器吸取，然后注入反应瓶中，缓慢搅拌15分钟。
[0058]
称取dcpo(358.98mg,1.15mmol)溶解在无水thf(35ml)中，用注射器吸取，逐滴滴加到上述反应瓶中。继续保持冰浴搅拌反应30分钟，撤去冰浴，室温下搅拌反应60分钟，之后缓慢升温至60℃，溶液回流，反应过程中，用tlc板监测，反应结束后，冷却至室温，加入去离子水10ml淬灭反应，然后用乙酸乙酯(5
×
30ml)萃取有机相，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，30分钟后，过滤除去无水硫酸钠，然后有机相旋蒸，浓缩，粗产物过硅胶柱(硅胶200-300目)，(pe:ea＝4:1，v:v)，得到红棕色固体，为荧光标记材料hccp-dcpo，其产量为382.36mg,产率为65％。
[0059]
荧光标记材料hccp-dcpo的核磁结果如图11-14所示。
[0060]
1h nmr(400mhz,cdcl3):δ/ppm 8.92(d,2h,j＝7.6hz),7.76(t,2h,j＝7.28hz),7.67-7.63(m,6h),7.59-7.53(m,6h),7.49-7.32(m,14h),7.13(d,4h,j＝7.96hz),6.88(s,2h),6.80(d,2h,j＝15.96hz).
[0061]
31p nmr(162mhz,cdcl3):δ/ppm 25.219(d,j＝93.31hz),9.275(t,j＝92.99hz).
[0062]
13c nmr(100mhz,cdcl3):δ/ppm 152.308,148.061,148.017,147.973,137.635,134.696,131.879,129.746,129.696,129.297,128.706,126.029,125.845,121.887,121.731,118.797,118.585,117.824,116.597,115.563,106.941.
[0063]
hr-ms(esi):calcd.for c
64h38
n7o8p3([m+na]
+
):1148.1892,found:1148.1878.
[0064]
对比例1二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚(dcpo)的制备
[0065]
其合成路线如下：
[0066][0067][0068]
(1)双氰亚甲基-4h-吡喃(dcm)的制备
[0069]
(1.1)室温条件下，100ml的乙酸乙酯加入250ml的单口烧瓶中，将2
’‑
羟基苯乙酮(dcm-3：5.0g,36.75mmol)加入到上述乙酸乙酯溶液中，缓慢搅拌，接着称取钠块(4.0g，173.9mmol)，将其小心切成小粒，缓慢加入到上述溶液中，室温下搅拌4个小时。
[0070]
tlc点板监测反应，待反应结束后，静置15分钟，过滤。将固体溶解在70ml去离子水中，调节溶液的ph值至中性。
[0071]
接着用100ml的乙酸乙酯萃取有机相，用过量的无水硫酸钠将有机层干燥，30分钟后，过滤，收齐溶液，旋蒸，浓缩得到化合物dcm-2。粗产物不用经过进一步的纯化，可以直接用于下一步反应。
[0072]
(1.2)在150ml的三颈烧瓶中加入乙酸(52ml)，然后加入步骤(1.1)得到的产物dcm-2，缓慢搅拌，接着向上述混合反应液逐滴加入浓硫酸(2.4ml)。逐渐升温至120℃，反应液开始回流。回流30分钟，tlc点板监测反应，直至dcm-2消失。降低温度至室温后，将反应液倒入700ml的冰水中。接着，用na2co3调溶液的ph至中性,用二氯甲烷萃取有机相三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，30分钟后，过滤除去无水硫酸钠，将溶液旋蒸，浓缩，冷却以后粗产物为无色的晶体dcm-1。粗产物不用经过进一步的纯化，可以直接进行下一步反应；
[0073]
(1.3)室温下，向100ml的三口烧瓶中加入乙酸酐(20ml)，然后加入dcm-1(2.35g,14.67mmol)和丙二腈(1.16g,17.61mmol)，搅拌溶解。逐渐升温至140℃回流。回流14个小时，tlc点板监测反应，直至dcm-1消失。冷却至室温，真空蒸发溶剂。向其中加入去离子水(40ml)，混合物再继续回流，30分钟。冷却至室温，用二氯甲烷萃取有机相，无水硫酸钠干燥30分钟。之后过滤除去无水硫酸钠，收齐有机相溶液，旋蒸，浓缩。粗产物过硅胶柱(硅胶:100-200目)，(pe:dcm＝10:1，v:v)，得到橘红色粉末固体，名称为双氰亚甲基-4h-吡喃，即dcm，产量为1.28g,产率为42％。
[0074]
荧光标记材料dcm的核磁结果如图1-3所示。
[0075]
(2)二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚(dcpo)的制备
[0076]
向三口烧瓶中加入200ml甲苯，然后加入dcm(1.664g,8.0mmol)和对羟基苯甲醛(813.74mg,6.6mmol)，缓慢搅拌。然后分别向上述反应液中，逐滴加入哌啶(3.2ml)和乙酸(3.2ml)。逐渐升温至130℃回流。回流14个小时，用tlc板监测反应，直至化合物dcm消失。静置，冷却至室温，有粘稠的沉淀产生。加入500ml的去离子水，有固体沉淀产生，过滤，干燥，得到红色固体粉末，名称为二氰基-亚甲基-4h-吡喃-苯酚，即dcpo，产量为1.25g产率为
60％。
[0077]
荧光标记材料dcpo的核磁结果如图4-6所示。
[0078]
实施例2荧光测试
[0079]
准确称取化合物hccp-dcpo的质量，并将其用dmso溶解，配制成5ml浓度为1
×
10-3
m的标准溶液即储备液。使用时，用相应的溶液将上述储备液稀释到所需要的浓度：将制备的储备液取20μl加不同溶剂稀释到2ml，材料最终浓度为1
×
10-5
m。
[0080]
荧光测试：如图15所示为dcpo,hccp-dcpo的荧光光谱图，从图中可以看出，dcpo具有更强的光学强度，连接了两个dcpo基团的hccp-dcpo的荧光强度并没有比其前体增强很多，相反，荧光强度略微有所下降。
[0081]
时间测试：如图16所示，hccp-dcpo在90min以内，显示出约10％的荧光强度变化，而其前体dcpo的荧光强度改变了约50％。
[0082]
实验结果说明了随着时间的延长，hccp-dcpo光信号衰减更慢。
[0083]
实施例3细胞培养
[0084]
以小鼠成纤维细胞(l929)为模型细胞来评价dcpo和hccp-dcpo两种荧光材料的细胞毒性。首先，收集对数生长期l929细胞，以8000/孔的密度将l929细胞种于96孔板中，在培养于含10％fbs和1％双抗的rpmi 1640培养基中，于5％co2，37℃条件下孵育过夜。
[0085]
然后，将培养基换成材料浓度分别为0nm、50nm、100nm、500nm、1000nm、2000nm、3000nm的含材料的培养基与细胞孵育24h，随后加入含10μl cck-8的dmem培养基，继续孵育2h。随后，在多功能酶标仪(spark10m，tecan)中测试每个孔中的溶液在450nm处的吸光度值，结果如图17所示。
[0086]
以上实验步骤采用的cck-8方法来评估hccp-dcpo的细胞毒性，小鼠成纤维细胞(l929)作为细胞模型。
[0087]
dcpo染料单体作为对照，采用和hccp-dcpo一样的方法进行了毒性测试。如图17所示，在试验浓度范围内hccp-dcpo处理过的l929细胞，其存活率均在80％以上，数据显示hccp-dcpo嫁接了两个dcpo染料以后，细胞毒性降低，具有更高的生物安全性。
[0088]
终上，hccp-dcpo具有较为理想的细胞相容性，可以作为潜在的细胞荧光标记材料。
[0089]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。