一种拟诺卡氏菌、化合物拟诺呋喃及其制备方法、应用

1.本发明天然药物医药技术领域，尤其涉及一种拟诺卡氏菌、化合物拟诺呋喃及其制备方法、应用。


背景技术：

2.心血管疾病发病率及死亡率现仍处于上升阶段。心血管疾病负担日趋严重，已成为重大的公共卫生问题。有研究证实，高脂血症是导致心血管疾病的主要因素之一，降低血脂水平能显著改善心血管疾病患者的生活质量并有效降低心血管疾病的发生率。
3.目前，他汀类药物是临床上用于治疗高脂血症的首选药物，但长期服用他汀类药物会造成相当一部分患者出现血糖升高、肌肉酸痛、横纹肌溶解、肝肾毒性等的毒副作用。因此，发现安全有效的新型降血脂药物具有重要的应用价值。天然产物是新药的重要来源，而海洋生物的多样性远远高于陆地，海洋中有着地球上80％的生物，丰富的生物多样性等于丰富的化学结构多样性。因此海洋将可能逐步成为新型药物发掘的主战场。
4.海洋生物药物是指从海洋动植物中提取的药物，海洋中丰富的海产动生物不仅为人类提供了大量的食品，也为人类提供了许多药物，而且许多海洋药物疗效显著、价格低廉、作用独特，因此研究海洋药物具有十分重要的意义。而海洋微生物天然产物是海洋药物的重要来源。海洋放线菌作为海洋微生物的重要组成部分，为海洋药物的开发提供了丰富的先导化合物，如来源于海洋放线菌salinispora tropica cnb-392的蛋白酶体抑制剂npi-0052已被fda 批准为用于治疗多发性骨髓瘤的孤儿药。海洋放线菌的次级代谢产物结构类型丰富，主要有聚酮类、聚醚类、醌类、生物碱类、大环内酯类以及肽类等。
5.因此，本发明以拟诺卡氏菌为研究对象，寻找具有降血脂活性的新型化合物及其制备方法。


技术实现要素：

6.为了提供一种具有降血脂作用的海洋天然活性化合物，本发明提供了一种拟诺卡氏菌制备的新化合物拟诺呋喃及其制备方法、应用。本发明提供的拟诺呋喃为海洋微生物来源的新化合物，能显著抑制hepg2细胞脂质模型中的脂质堆积，用于制备降血脂药物或降血脂的保健食品。
7.本发明的具体方案为：一方面，本发明提供了一种化合物拟诺呋喃，通过分析拟诺呋喃的高分辨质谱hresims、氢谱、碳谱、hmqc谱、hmbc谱和cosy谱图数据，确定了化合物拟诺呋喃的化学结构。其化学结构式如下：
8.本发明所提供的化合物拟诺呋喃为一个新化合物。经一系列研究表明，拟诺呋喃能显著hepg2细胞脂质模型中的脂质积累，具有降血脂生物活性。本发明提供了一种能应用在制备降血脂药物中的新化合物。
9.另一方面，本发明提供了一种拟诺卡氏菌，所述拟诺卡氏菌命名为zhd001，已于2022 年06月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，其微生物保藏编号为cctcc no：m 2022921，微生物分类命名为拟诺卡氏菌nocardiopsis sp.。
10.上述菌株是本技术人首次从舟山周边海域采集的沉积物分离得到的，目前尚未有公开文献对该菌株进行报道。本技术人通过研究发现，菌株zhd001在发酵后对hepg2细胞的脂质积累具有出色的抑制活性，证实菌株zhd001具有降血脂生物活性。通过进一步研究证实，菌株zhd001发酵后能产生前面所述的化合物拟诺呋喃。
11.另外，本发明提供了一种新化合物拟诺呋喃的制备方法。所述拟诺呋喃的制备方法包括以下步骤：(1)利用菌株zhd001在液体培养基中进行发酵，得到含有化合物拟诺呋喃的发酵液；(2)将所述发酵液经有机溶剂提取后获得有机提取液；(3)将有机提取液浓缩，分离纯化，获得拟诺呋喃。
12.作为优选，步骤(1)中的发酵条件为：发酵培养基为液体培养基；发酵温度为28～32℃；发酵时间为10～12天。所述液体培养基优选高氏一号液体培养基。
13.作为优选，步骤(2)中，所述的有机溶剂为酯类有机溶剂。进一步优选，所述的有机溶剂为乙酸乙酯。
14.具体地，步骤(3)中所述的有机提取液浓缩方法优选：真空或减压干燥除去部分溶剂。
15.具体地，步骤(3)中所述的分离纯化步骤为：(a)浓缩后产物采用硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集洗脱液，检测各组分，合并含有拟诺呋喃的组分； (b)将所得组分采用制备型高效液相色谱分离纯化得到拟诺呋喃，所述制备型高效液相色谱分离方法包括：采用安捷伦pursuit c18色谱柱21.2
×
250mm，10μm，检测波长为210nm，采用体积百分数为10-20％的乙腈-水体系，以10ml/min进行等度洗脱；收集32.2～33.5分钟的洗脱液。优选地，步骤(a)中，所述的二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度为95～110:1，70～90:1， 40～60:1，25～35:1，15～20:1,8～12:1，4～7:1，1～3:1和0～0.5:1。
16.本发明所述新化合物拟诺呋喃具有如下作用：(1)为进一步测试本发明分离得到拟诺呋喃的生物活性，采用hepg2细胞脂质模型进行体外降血脂活性评价。试验表明，本发明分离得到拟诺呋喃能显著hepg2细胞脂质模型中的脂质积累，具有降血脂生物活性。
17.(2)降低血脂水平能显著改善心血管疾病患者的生活质量并有效降低心血管疾病
的发生率，拟诺呋喃可用于制备降血脂的药物或降血脂的保健食品，为人类健康助力。
18.(3)拟诺呋喃为具有降血脂活性的天然产物新化合物，对发现安全有效的新型降血脂药物具有重要的应用价值。
附图说明
19.图1是拟诺呋喃的高分辨质谱图；图2是拟诺呋喃的氢图；图3是拟诺呋喃的碳图；图4是拟诺呋喃的hsqc图；图5是拟诺呋喃的hmbc图；图6是拟诺呋喃的cosy图；图7是拟诺呋喃的降血脂活性的测试数据。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
21.实施例1一、菌株zhd001的获取由舟山周边海域采集的沉积物分离得到拟诺卡氏菌菌株zhd001。于2022年06月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉，其微生物保藏编号为cctcc no：m 2022921，微生物分类命名为拟诺卡氏菌nocardiopsis sp.。
22.二、拟诺卡氏菌nocardiopsis sp.zhd001发酵液的制备取拟诺卡氏菌菌株zhd001适量，接种到高氏一号固体培养基上，然后放于37℃培养箱中静置，活化培养3天。将已经活化的拟诺卡氏菌菌株zhd001的单菌落接种于500ml锥形瓶中，每瓶含250ml高氏一号液体培养基，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养10天，获得发酵液。所用高氏一号固体培养基配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，海盐25g，水1l。所用高氏一号液体培养基配方为：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、海盐 25g，水1l。
23.三、拟诺呋喃的制备将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯萃取液经旋转蒸发仪减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂得到浓缩液。将所得浓缩液采用硅胶柱色谱分离，用混合梯度为100:1，80:1，50:1， 30:1，20:1，10:1,5:1，1:1和0:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层层析检测各组分，合并含有拟诺呋喃的组分。
24.所得含有新化合物的馏分用制备型岛津lc-20ap高效液相色谱仪分离纯化，安捷伦 pursuit c18色谱柱21.2
×
250mm，10μm,检测波长为210nm，采用体积百分数为15％的乙腈-水体系，以10ml/min进行等度洗脱，收集32.2～33.5分钟的洗脱液得到活性化合物拟诺呋喃。
25.四、拟诺呋喃结构确证拟诺呋喃，淡黄色粉末，溶于甲醇。分子式根据高分辨质谱hresims计算为c
16h22o7 ([m
+
na]
+
349.1264)，拟诺呋喃的高分辨质谱图如图1所示。如图2～图6所示，分别为拟诺呋
喃的氢谱、碳谱、hmqc谱、hmbc谱和cosy谱图，通过分析这些谱图数据，确定了拟诺呋喃的化学结构，为一个新化合物。
[0026]
拟诺呋喃的核磁共振数据归属见表1。表1拟诺呋喃的
13
c(150mhz)和1h(600mhz)nmr数据(溶剂为氘代甲醇methanol-d4)
[0027]
所述拟诺呋喃的化学结构为：
[0028]
四、拟诺呋喃的降血脂活性hepg2细胞用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基，在37℃、体积分数5％co2的饱和湿度条件下培养，每3天用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，按1:3进行传代，取对数期的细胞制成悬液，接种于24孔板，孵育24h后，将实验分为4组：
①
空白对照组：含10％fbs的dmem 培养基培养24h；
②
模型组：1mm油酸的dmem培养基培养24h；
③
阳性对照组：1mm油酸和辛伐他汀(10μm)的dmem培养基培养24h；
④
样品组：1mm油酸和拟诺呋喃(10μ m)的dmem培养基培养24h。
[0029]
各组去除培养液，pbs冲洗3次，每孔加入80μl 4％多聚甲醛固定40min后，pbs 冲洗3次，用质量比为60％异丙醇/水处理10分钟后，加入50μl油红工作液(工作液由0.3 g/100ml油红/异丙醇的母液与水体积比3：2配制而成)20min后，去除油红工作液，pbs 冲洗3次，倒置显微镜观察细胞内脂滴染色情况。用80μl异丙醇溶解被染色的脂滴后，在酶标仪520nm波长下测od值。实验结果如图7所示(与模型组比较,***p《0.001；**p《0.001； *p《0.01)。结果表明，拟诺呋喃可显著抑制hepg2脂质模型的脂质堆积。
[0030]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中
所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0031]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。