一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法

本发明属于生物技术和基因工程，具体的，本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的方法。

背景技术：

1、随着全球范围内耐药菌的不断增加，新药研发速度远低于耐药菌的进化速度，加上化学药物的开发难度和投入费用逐渐增加，抗菌肽以其独特的优势成为今年来药物开发的研究热点。化学合成方法获取抗菌肽的成本高；直接从生物体中分离纯化则相对复杂。随着生物技术的不断发展，利用基因工程和发酵工程技术生产药物蛋白或多肽成为一种经济高效的生产方式。

2、目前，已有众多抗菌肽在异源宿主中表达，其中大多数的抗菌肽在大肠杆菌和酵母表达系统中表达。但大肠杆菌表达系统易形成包涵体、细胞壁含有致病性内毒素等；酵母表达系统后期大规模发酵通常需要较复杂的培养基，需要甲醇作为碳源，因而生产成本较高。枯草芽孢杆菌是一种被公认为安全的微生物。它能将重组蛋白分泌至胞外，不易形成包涵体，细胞壁无内毒素，且后期发酵成本远低于酵母表达系统。但目前在枯草芽孢杆菌中重组表达抗菌肽的报道较少。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的方法。

2、本发明所用的抗菌肽kr32对益生菌的生长无明显毒性，因此采用自分泌表达载体，直接由枯草芽孢杆菌在产生次级代谢产物（如酶和酸等）的同时分泌表达抗菌肽kr32。相比与常见的诱导融合表达策略，省去了添加了诱导剂带来的毒性问题，无需使用纯化标签进行纯化、无需使用特定的酶对融合标签进行切割，也省去了切割后再纯化的繁琐步骤，为直接应用重组枯草芽孢杆菌提供了便利。同时体内试验表明，灌胃重组菌能够有效的抵御k88攻毒导致的

3、料重比增加，平均日增重降低。能够部分挽回仔猪因感染大肠杆菌k88带来的经济损失。

4、一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法，包括以下步骤：

5、1）将外源蛋白kr32基因，序列如seq id no:1所示，插入枯草芽孢杆菌自分泌表达载体pbe2r得到外源蛋白枯草芽孢杆菌自分泌表达载体pbe2r-kr32；

6、2）外源蛋白枯草芽孢杆菌分泌表达载体经电转导入在枯草芽孢杆菌 b. subtiliswb800，构建得到了 b. subtilis wb800/pbe2r-kr32菌株，用于高效表达，分泌外源蛋白。

7、所述的方法，使用液质联用技术对构建的 b. subtilis wb800/pbe2r-kr32的发酵上清进行检测，该检测限低至10ppb，而液相色谱技术的检出限为50ppm。

8、所述的方法，在仔猪上的试验灌胃 b. subtilis wb800/pbe2r-kr32菌株14天，后连续进行3天k88灌胃攻毒，1*1010 cfu/d，能够有效的抵御k88攻毒导致的料重比增加，平均日增重降低，与空白对照组无显著差异。

9、本发明的有益效果：

10、1. 首次在枯草芽孢杆菌表达系统中成功表达具有活性的kr32，为使用自分泌表达载体在枯草芽孢杆菌表达系统中祖冲表达抗菌肽提供了可能。

11、2. 使用本发明在重组表达抗菌肽时，无需经过诱导剂诱导，直接分泌至胞外，并且重组抗菌肽不含内毒素，省去了大量下游纯化的工作。

12、3. 使用本发明表达抗菌肽未见对宿主有毒性作用。

技术特征：

1.一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用液质联用技术对构建的b. subtiliswb800/pbe2r-kr32的发酵上清进行检测，该检测限低至10ppb。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在仔猪上的试验灌胃b. subtilis wb800/pbe2r-kr32菌株14天，后连续进行3天k88灌胃攻毒，1*1010 cfu/d，能够有效的抵御k88攻毒导致的料重比增加，平均日增重降低。

技术总结
本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌自分泌表达外源蛋白的方法。通过构建KR32枯草芽孢杆菌分泌表达载体，实现无需添加外源诱导剂，即可实现分泌表达KR32；用重组表达得到的含抗菌肽KR32的上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均有显著的抑制作用。本发明为在枯草芽孢杆菌表达系统中自分泌重组表达抗菌肽提供了可能；自分泌表达直接分泌至胞外，无需经过外源诱导剂诱导，避免了诱导剂的毒性，同时省去了诱导剂成本；同时直接分泌表达对宿主的生长无明显抑制作用。使用液质联用技术对枯草芽孢杆菌分泌的KR32进行检测，能够检测到目标物的峰。对21日龄仔猪灌胃该菌14天，后连续进行3天K88灌胃攻毒（1*10<supgt;10 </supgt;cfu/d）发现其能够显著抵御大肠杆菌k88。

技术研发人员：汪以真,文超越,张红,靳明亮,王凤芹
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11