一种重组表达PEDVS蛋白受体RBD结构域的PRRSV活载体疫苗株的构建及应用

本发明涉及生物领域，涉及一种重组表达pedv s蛋白受体rbd结构域的优势抗原表位肽的prrsv活载体疫苗株的构建及应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是造成世界养猪业巨大经济损失的一种高度接触性肠道传染病，在新生仔猪群中流行广泛且危害严重，对世界养猪业者造成了重大经济损失。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)是引起该病的主要病原，pedv可以感染所有年龄的猪并引起临床症状，但感染猪的严重程度和死亡率与猪年龄成反比，其中对10日龄以内新生哺乳仔猪影响最大，主要表现为水样腹泻、呕吐、脱水、消瘦和死亡等，对新生哺乳仔猪发病率和致死率甚至可高达80-100％。pedv是一种有囊膜的单股正链rna病毒，属于套式病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，α-冠状病毒亚群的成员。2010年年底新出现了一种变异的pedv毒株，对新生哺乳仔猪致病力强，且传播速度快，导致哺乳仔猪群大面积暴发急性腹泻疫情，发病率和死亡率居高不下。由于发生变异的pedv传播速度快，感染性强，使其成为当前对新生仔猪威胁最大的头号病毒性传染病。目前人们将2010年以前的pedv分离株归为g1亚群，而2010年以后pedv变异毒株被归为g2亚群。

2、pedv基因组长约28kb，包含5′和3′非翻译区(utr)和至少7个开放阅读框(orf)，依次为orf1a、orf1b、刺突蛋白(s)、辅助蛋白orf3、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(n)。其中orf1在5′末端约占基因组全长的三分之二，编码两种多聚蛋白pp1a和pp1ab，pp1a和pp1ab被木瓜蛋白酶和3c样丝氨酸蛋白酶切割为16个非结构蛋白nsp1-16，这些nsps主要参与病毒复制、转录、翻译和病毒蛋白加工。pedv s糖蛋白位于病毒颗粒的表面，是一种同源三聚体膜糖蛋白，由s1和s2两个亚基组成，s1介导pedv与宿主受体结合，s2诱导膜融合和pedv入侵。s1蛋白的n端(ntd)具有神经氨酸酶结合活性，c端(ctd)包含细胞受体结合功能域(rbd)，主要负责识别宿主细胞面受体，并介导病毒吸附，针对pedv rbd的抗体可以抑制pedv s蛋白识别宿主细胞受体，因此rbd区域也是病毒感染过程中宿主免疫防御的主要靶点，通常被用作疫苗开发的靶标。

3、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)是一种具有重要经济意义的传染病，其主要临床症状是各年龄段猪发生呼吸道疾病和母猪繁殖障碍。prrs的病原体是猪繁殖与呼吸综合征(prrsv)，自1987年首次报道以来，prrsv一直是全球养猪业面临的主要挑战之一，并且仍然在不断发生变异导致新的流行，据报道仅在美国，prrsv感染每年给养猪业可造成约6.64亿美元的损失。prrsv也是一种单股正链rna病毒，prrsv感染的靶细胞主要是单核-巨噬细胞，其中最典型的是肺泡巨噬细胞(pams)。prrsv主要有两种基因型，即prrsv1和prrsv2，两种基因型毒株之间核苷酸和氨基酸的同源性分别仅为60％和56％，但两种类型毒株所引起的临床症状、病理损伤特点和组织嗜性等都是相似的。其中prrsv1在欧洲流行普遍，prrsv2在美洲和亚洲流行普遍，但在欧洲、北美州和亚洲也同时存在这两种类型毒株分离的报道。目前，在我国猪群中流行的主要是以prrsv2毒株为主，由于prrsv容易发生变异和重组，临床上流行的prrsv毒株也复杂多样，呈现包括经典的ch-1a类prrsv、高致病性prrsv、nadc30-like和nadc34-like prrsv等不同亚型毒株共存的现象，同时，还存在由这上述不同毒株发生重组而来新的变异毒株。因此prrsv也是我国养猪业中最受困扰的病毒之一。

4、prrsv和pedv的混合感染在我国较为普遍，为了控制prrs和ped，除了加强生物安全管理措施而外，疫苗接种是目前最常用和最为有效预防prrs和ped的策略之一，通过疫苗接种能够最大限度地减少由prrsv和pedv感染造成的经济损失。目前用于预防prrs和ped的疫苗主要包括活疫苗和灭活疫苗，其中prrsv灭活疫苗虽然安全，但其提供的免疫保护有限，活疫苗能够提供有效的免疫保护。但是针对不同病原的感染，尚无疫苗可同时预防ped和prrs。而依赖单一疫苗的频繁免疫接种，不仅增加了疫苗接种成本，而且会对猪群造成过度的免疫应激，影响猪的生产性能，因此，有必要设计一种多价疫苗以用于同时预防prrsv和pedv两种不同病原的感染。s蛋白位于病毒颗粒的表面，可介导识别受体和膜融合，含有能够诱导产生中和抗体的中和性抗原表位，是研发冠状病毒候选疫苗的理想抗原。但是并非s蛋白中所有的抗原表位都能诱导产生中和性抗体，已有研究证实在完整的s蛋白或s1蛋白中还存在很多诱导非中和抗体的抗原表位，而非中和性抗体中也包含与病毒感染的抗体依赖性增强(ade)相关或与有害免疫反应相关的抗体，潜在不可控的风险因素比较多，对于安全高效疫苗的研发是不利的。pedv入侵宿主细胞主要依赖s蛋白利用其受体结合结构域(rbd)与宿主细胞受体结合，使病毒进入宿主细胞，由此可见，针对靶向s蛋白rbd区域的中和抗体能够阻断s蛋白与受体的结合，从而阻止pedv感染。prrsv弱毒疫苗hun4-f112株在临床上已被广泛用于预防高致病性prrsv的感染，且已证实prrsv基因组适合作为表达外源基因的载体，但其容纳外源基因大小是有限的，引入的外源基因过大，会导致外源基因突变或丢失，容易造成重组病毒的遗传不稳定，因此，选择适当大小的外源基因是构建重组疫苗的关键。本研究旨在prrsv活疫苗株hun4～f112的基础上，有针对性性的选择主要包含rbd结构域的pedv s蛋白ctd结构域作为靶抗原，减少了大量冗余抗原表位，最大限度地降低ade效应的风险因素，构建能够稳定重组表达pedv s蛋白优势抗原区域的prrsv弱毒疫苗株，该疫苗株能够诱导机体产生集中靶向pedv rbd结构域的中和抗体，阻止病毒对宿主细胞受体的识别，从而降低病毒的感染能力，为prrs和ped的防控提供技术支撑。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明的目的是：

2、提供一种针对pedv的s蛋白受体rbd结构域的融合抗原表位肽，所述s蛋白rbd功能域的优势抗原区域是根据gene bank中公布的pedv流行变异毒株fjzz1株s基因序列(登录号：mk288006)，利用dnastar软件进行氨基酸序列的分析，选择位于s基因中s1亚基的c端结构域(1495-2377nt，编码氨基酸位置：aa 496-792)，该区域主要分布于s蛋白胞外域三聚体的表面，包含pedv潜在的rbd结构域，抗原性指数最高3.4。并在其前端引入s基因的信号肽序列，将该目的基因命名为rbd1，如seq id no.1所示。

3、进一步的，本发明提供上述s蛋白受体rbd结构域的融合抗原表位肽的应用，所述应用为开发针对prrs和ped的二价基因工程活疫苗；

4、进一步的，本发明提供一种表达s蛋白受体rbd结构域的融合抗原表位肽的重组prrsv phun4-f112-srbd1疫苗株，其特征在于表达上述s蛋白受体rbd结构域的融合抗原表位肽。

5、进一步的，本发明提供重组prrsv phun4-f112-srbd1疫苗株的应用，所述应用为以prrs疫苗毒株作为载体，递送来自ped的外源基因，能够保护猪免受prrsv和ped的侵害，将有利于提高prrsv疫苗的使用效率，适用于新型基因工程疫苗的研发。

6、进一步的，所述抗原表位肽n端或c端还可以偶联有多肽标记；优选地，所述多肽标记为生物素标记或荧光标记。

7、进一步提供了上述的抗原表位肽在制备开发针对prrs和ped的二价基因工程活疫苗中的应用。

8、进一步的，本发明提供一种表达pedv s蛋白优势抗原区域的重组prrsv phun4-f112-srbd1疫苗株，其特征在于所述pedv s蛋白优势抗原区域为上述s蛋白融合抗原表位肽。

9、进一步的，本发明提供重组prrsv phun4-f112-srbd1疫苗株的应用，所述应用为以prrs疫苗毒株作为载体，递送来自ped的外源基因，能够保护猪免受prrsv和ped的侵害，将有利于提高prrsv疫苗的使用效率，适用于新型基因工程疫苗的研发。

10、本发明还提供了上述的抗原表位肽在制备用于预防或治疗prrs和ped的药物中的应用。

11、本发明进一步提供了上述的抗原表位肽作为抗prrs和ped感染药物筛选靶标的应用。

12、进一步的，本发明的一个实施方案中，还提供了一种用于预防或治疗prrs和ped感染的药物组合物，其包含上述的抗原表位肽和药学上可接受的辅料。

13、在根据本发明的一个实施方案中，还包含佐剂，所述佐剂可选addavax。

14、进一步的，在根据本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为经鼻施用的剂型；优选为喷雾剂、滴鼻剂、粉末剂、凝胶制剂或微球制剂。

15、本发明进一步提供了一种用于prrs和ped感染的诊断试剂，其包含上述的抗原表位肽，所述抗原表位肽包被于检测载体上，所述检测载体选自聚苯乙烯微量反应板、胶体金试剂条、磁珠和微流控芯片中的任一种。

16、有益效果

17、本发明中提供的重组抗原主要针对pedv s蛋白的受体结合结构域(rbd)，减少了完整s蛋白中大量冗余抗原表位，降低了抗体依赖性增强(ade)效应的风险因素，提高了疫苗的安全性。

18、所构建的重组病毒选择的抗原能够刺激机体重点集中产生针对流行变异pedv的rbd区域的中和抗体，提高了重组抗原诱导抗体的靶向性。

19、所构建的重组病毒引入pedv变异流行毒株的rbd结构域基因大小960bp，是prrsv基因组可容纳的基因大小，所获得的重组病毒不容易发生突变和缺失，保障了重组病毒的稳定性。

20、进一步的，本发明中提供的重组病毒prrsv phun4-f112-srbd1疫苗株在细胞培养中可稳定表达pedv s蛋白受体rbd结构域的融合抗原表位肽，可以作为今后开发用于预防prrs和ped的新型基因工程活载体疫苗的候选毒株。

21、所构建的重组病毒接种试验猪不会引起异常的临床表现，也不会对机体造成病理损伤，对猪具有安全性。

22、所构建的重组病毒接种试验猪可同时诱导产生针对prrsv和pedv的特异性免疫反应，产生的中和抗体可有效中和pedv变异流行株，降低pedv的感染能力。