椰子致死性植原体通用型快速可视化检测试剂盒及应用

本发明属于生物，涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种基于6组椰子致死性植原体16s rrna基因序列，通过多重比对获得6组植原体的保守区域序列，基于椰子致死性植原体的保守区域序列特征及其遗传变异规律，设计、筛选获得2套通用型椰子致死性植原体快速可视化检测引物组的试剂盒及应用。

背景技术：

1、植原体是一类寄生于植物韧皮部、通过刺吸式口器昆虫传播、尚不能分离培养的原核病原菌。由植原体引起的植物病害目前尚无有效的治疗剂，是植物的毁灭性病害，因此该类病害以防为主。椰子是我国华南沿海地区及海南岛主要的特色经济作物和重要的文化标志，具有重要的经济、绿化、文化、生态价值。由植原体引起的椰子致死性病害是椰子种植上的一种毁灭性病害，该病害传播快、致病性高、危害十分严重。椰子致死性黄化植原体种类丰富、地理分布广泛。地理分布上，在美洲、非洲和东南亚等地区均有分布。椰子致死性黄化相关植原体的种类，包括16sri(-b)、16sriv(-a、-b、-c、-e、-f)、16srxi(-a、-b)、16srxiv、16srxxii(-a、-b)、16srxxxii(-b)等多个组或亚组，不同组的椰子致死性植原体遗传变异水平较高。截止目前，我国尚未见椰子致死性植原体病害的相关报道。但是已有研究表明：我国为椰子植原体的适生区，我国华南沿海及海南大部分地区为中、高风险区。华南沿海及海南大部分地区是我国椰子主产区，一旦国外椰子致死性植原体入侵，对于海南乃至我国的椰子产业将是毁灭性的打击。

2、椰子致死性病原菌植原体有6组15个亚组以上，已报道的椰子致死性植原体通用型检测方法仅有巢式pcr一种，巢式pcr需要进行两轮pcr扩增，操作复杂，该方法反应时间较长，约为5个小时，且二轮pcr易造成污染，检测结果需要通过基因测序做确定。因此，开展相关快速高效的椰子致死性植原体检测技术研究对于相关病害的检测、监测至关重要。环介导等温扩增技术是一种通过恒温核酸扩增进行分子诊断的方法。该方法具有特异性强、操作简单、不需要复杂仪器、检测周期短和检测结果可视化的特点，非常适合作为基层和现场的病害诊断方法进行推广和使用。椰子致死性植原体种类多，不同组别、不同寄主的植原体持家基因如16s rrna、tuf等存在不同程度的变异水平，基于不同变异程度、不同靶标基因设计的引物组，在不同组别、不同寄主的植原体环介导等温扩增检测中，特异性、灵敏度等均存在显著差异。已报道的相关快速可视化检测技术主要针对一个组或亚组，nair等基于印度椰子植原体的16srrna基因序列建立了16srxi组椰子植原体环介导等温扩增检测技术；lu等基于巴布亚新几内亚椰子植原体的16srrna基因序列建立了16sriv组椰子植原体环介导等温扩增检测技术。这些环介导等温扩增引物组主要针对不同16srxi组或16sriv组，不具备通用性，其它组的椰子致死性植原体不能被很好的检测。

3、为研发椰子致死性植原体通用型快速可视化检测技术，提高椰子致死性植原体检测效率及检测客观性，不因椰子致死性植原体种类差异而造成漏检，建立椰子致死性植原体高灵敏度检测技术势在必行。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种椰子致死性植原体通用型快速可视化检测试剂盒，基于椰子致死性植原体的保守区域序列特征及其遗传变异规律，设计、筛选获得2套通用型椰子致死性植原体快速可视化检测引物组co-4和co-6，建立了针对不同椰子致死性植原体通用型快速可视化检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供椰子致死性植原体通用型快速可视化检测试剂盒，包括引物组co-4或co-6；

3、所述co-4引物组包括核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示的正向外引物、核苷酸序列如序列表中seq id no:2所示的反向外引物、核苷酸序列如序列表中seq id no:3所示的正向内引物、核苷酸序列如序列表中seq id no:4所示的反向内引物、以及核苷酸序列如序列表中seq id no:5所示的正向环引物；

4、所述co-6引物组包括核苷酸序列如序列表中seq id no:6所示的正向外引物、核苷酸序列如序列表中seq id no:7所示的反向外引物、核苷酸序列如序列表中seq id no:8所示的正向内引物、核苷酸序列如序列表中seq id no:9所示的反向内引物、核苷酸序列如序列表中seq id no:10所示的正向环引物、以及核苷酸序列如序列表中seq id no:11所示的反向环引物。

5、本发明的另一目的在于提供试剂盒在检测椰子致死性植原体中的应用。

6、本发明椰子致死性植原体通用型快速可视化检测试剂盒具有以下的有益效果：

7、1、本发明椰子致死性植原体通用型快速可视化检测试剂盒用于检测反应只需64℃恒温扩增30-40min即可完成，检测结果通过反应体系颜色变化即可判断，方便快捷。针对16sri、16sriv、16srxi、16srxiv、16srxxii、16srxxxii共6组椰子致死性植原体，通用型快速可视化检测引物组co-4最低检测限范围为0.1ag/μl-1pg/μl；通用型快速可视化检测引物组co-6最低检测限范围为1ag/μl-1pg/μl。

8、2、本发明根据genbank已报道的6类属于不同组的椰子致死性植原体16srrna基因序列的多重比对分析，获取6组椰子致死性植原体的16srrna基因保守区域序列。针对多种椰子致死性植原体的保守区域序列及其遗传变异特征，设计、筛选快速可视化检测引物组，建立针对不同椰子致死性植原体通用型的快速可视化检测技术。本发明获得的椰子致死性植原体通用型快速可视化检测技术，将有助于提高我国有害生物检验检疫手段和技术水平，阻挡外来有害生物于国门之外，降低其入侵风险。本技术在相关病害的口岸检验检疫、田间快速诊断等方面具有极其广泛的应用前景。

技术特征：

1.椰子致死性植原体通用型快速可视化检测试剂盒，其特征在于：包括引物组co-6；

2.权利要求1所述的试剂盒在检测椰子致死性植原体中的应用。

技术总结
本发明公开了一种椰子致死性植原体通用型快速可视化检测试剂盒及应用，本发明基于6组椰子致死性植原体16S rRNA基因序列，通过多重比对获得6组植原体的保守区域序列。基于椰子致死性植原体的保守区域序列特征及其遗传变异规律，设计、筛选获得2套通用型椰子致死性植原体快速可视化检测引物组Co‑4和Co‑6，建立了针对不同椰子致死性植原体通用型快速可视化检测方法。椰子致死性植原体通用型快速可视化方法整个检测反应只需64℃恒温扩增30‑40min即可完成，检测结果通过反应体系颜色变化即可判断，方便快捷。针对16SrI、16SrIV、16SrXI、16SrXIV、16SrXXII、16SrXXXII共6组椰子致死性植原体，通用型快速可视化检测引物组Co‑4最低检测限范围为0.1ag/μL‑1pg/μL；通用型快速可视化检测引物组Co‑6最低检测限范围为1ag/μL‑1pg/μL。

技术研发人员：于少帅,潘英文,朱辉,宋薇薇
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院椰子研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11