花菁染料、其制备方法及其用途与流程

本技术涉及一种荧光染料，特别涉及花菁染料、其制备方法及其用途。本技术还涉及包含所述花菁染料的缀合物以及用于生物样品染色的组合物。

背景技术：

1、dna(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)是一类带有遗传信息的生物大分子。生物体正常细胞一般具有比较稳定的dna二倍体含量，而当发生病变时，会发生异常改变；且不同种类生物体的dna含量一般有所不同。因此对dna的特异性识别和精确测量，尤其是在活细胞内进行检测，具有重大意义。利用荧光染料进行dna的定性或定量分析因具有灵敏度高、响应快等优点而引起广大科研工作者的兴趣。

2、目前，商品化的染料主要有菲啶类、吖啶类、咪唑类和花菁家族类等。然而，这些染料应用过程都存在着一定的局限性。其一，较大一部分染料与dna结合后呈现荧光淬灭，导致在荧光成像等可视化应用中实用价值不高。其二，当前大部分染料的专一性较差，无法特异性地与dna相结合，极大地限制其应用潜力。其三，目前多数染料本身有很大的毒性和致癌性，且需通过增大细胞膜的通透性才能对进行生物样品标记。然而，这种通透性处理对细胞和生物组织造成损害，限制了在活细胞中的应用。

3、在众多荧光染料中，花菁类荧光染料因其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光探针等已被广泛的应用。尽管花菁类染料中的部分已被商品化，但这些染料大部分分子较大，结构复杂，活细胞通透性低。此外，大多数染料的斯托克位移较小，导致激发光谱与发射光谱之间严重串扰，造成背景干扰和荧光自淬灭现象，限制了其应用。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本技术的发明人通过分子修饰，获得了新的苯并噻唑类的花菁染料，其热稳定性有较明显的改善，而且相比于现有苯并噻唑类的花菁染料，本发明的花菁染料具有高的生物穿透力，更适合用于细胞染料及成像。

2、化合物

3、在第一方面，本技术提供了具有如通式i所示结构的化合物或其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型，

4、

5、其中，

6、r1和r2相同或不同，并且独立地选自c1-18直链或支链烷基、c1-18直链或支链亚烷基-m，m选自磺酸基、苯基、羧基、巯基、氨基；

7、r3选自氢、磺酸基、卤素、氰基、c1-6烷基、羟基、c1-6烷氧基、卤代c1-6烷基；

8、y不存在或为抗衡阴离子；

9、并且限定：

10、当r3为氢时，r1和r2不同时为甲基且r1和r2不同时为苄基。

11、本发明的化合物中，r1和r2可以相同，也可以不同。在一些实施方案中，r1和r2独立地选自c1-6直链烷基、c1-6直链亚烷基-m，m选自磺酸基、苯基、羧基、巯基、氨基。

12、在一些实施方案中，r1和r2中的至少一个为c1-18直链或支链亚烷基-磺酸基。

13、在一些实施方案中，r1和r2不同且独立地选自c1-6直链烷基、苄基、c1-6直链亚烷基-羧基、c1-6直链亚烷基-磺酸基、c1-6直链亚烷基-巯基、c1-6直链亚烷基-氨基。

14、在一些实施方案中，r1和r2相同且选自c1-6直链烷基、c1-6直链亚烷基-磺酸基、c1-6直链亚烷基-羧基。

15、在一些实施方案中，，r3选自氢、磺酸基、卤素、氰基、c1-6烷基。

16、在一些实施方案中，通式i中的y为抗衡阴离子，此时，y可以选自卤素离子(例如f-、cl-、br-、i-)、clo4-、pf6-、cf3so3-、bf4-、乙酸根、甲磺酸根或对甲苯磺酸根。

17、在一些实施方案中，通式i中的y不存在，此时，所述化合物可以为内盐。“内盐”在本领域中还被称为“两性离子”。在一些实施方案中，本发明的化合物可以在分子内同时含有酸性基团(例如磺酸基或羧基)和碱性基团(例如氨基或噻唑环)，所述酸性基团和碱性基团互相中和而生成内盐。

18、应当理解的是，当化合物分子中含有多个酸性基团和/或多个碱性基团时，各酸性基团和/或各碱性基团都可能作为成盐基团。化合物由各种成盐方式形成的盐均包含在本发明的范围内。

19、在一些实施方案中，r1和r2中的至少一个选自c1-18直链或支链亚烷基-磺酸基、c1-18直链或支链亚烷基-羧基。

20、本发明的化合物可以具有以下任一结构：

21、

22、

23、在一些实施方案中，本发明的化合物为上述结构式5、6或9代表的化合物。

24、缀合物和用于生物样品染色的组合物

25、本发明的化合物及其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型可以直接用于生物样品的染色，也可以衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。

26、本文中使用的“缀合物”是指本发明的化合物、其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明的化合物、其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物温育一段时间，使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该荧光缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在包含激发光源和测定装置的分析仪器中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。

27、本技术还提供了一种用于生物样品染色的组合物，其中所述组合物包含本发明的化合物、其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型、或本发明的缀合物。在一些实施方案中，所述生物样品为核酸。在一些实施方案中，所述生物样品为脱氧核糖核酸。

28、用途

29、本技术还提供了本发明的化合物、其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型、或本发明的缀合物、或本发明的组合物在对生物样品进行染色中的用途。在一些实施方案中，所述生物样品为核酸。在一些实施方案中，所述生物样品为脱氧核糖核酸。

30、本技术还提供了本发明的化合物或其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型、或本发明的缀合物、或本发明的组合物在采用流式细胞术识别待测血液样本中的寄生虫中的用途。在一些实施方案中，所述寄生虫选自：蛔虫、钩虫、绦虫、阴道毛滴虫、肝吸虫、卫斯特曼氏并殖吸虫、弓形虫、猪囊虫、旋毛虫、阿米巴虫、杜氏利什曼原虫、疟原虫、血吸虫、丝虫、包虫、疥螨、毛囊螨、虱子、跳蚤。

31、本技术还提供了本发明的化合物或其水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或晶型、或本发明的缀合物、或本发明的组合物在采用流式细胞术识别待测血液样本或待测体液样本中的微生物中的用途。

32、在一些实施方案中，所述微生物选自：

33、细菌(例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、痢疾杆菌、百日咳杆菌、白喉杆菌、脑膜炎双球菌、结核分枝杆菌、破伤风梭状杆菌、麻风杆菌、a组溶血性链球菌、布鲁氏菌、霍乱杆菌、伤寒杆菌、炭疽杆菌、淋病奈瑟菌、霍乱弧菌、克雷伯氏假单孢菌、以及副伤寒甲、乙或丙沙门杆菌)，

34、病毒(例如流感病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、乙脑病毒、登革病毒、流行性出血热病毒、狂犬病毒、人乳头状病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、水痘带状疱疹病毒、肝炎病毒、新型肠道病毒70型、柯萨奇病毒a24型变种、人免疫缺陷病毒、痘病毒(例如猴痘病毒))，

35、真菌(例如白色念珠菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌)，

36、支原体(例如肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体)，

37、衣原体(例如沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉衣原体、家畜衣原体)，

38、立克次氏体(例如普氏立克次氏体、莫氏立克次氏体、立克次氏立克次氏体、恙虫病立克次氏体)，

39、放线菌(例如以色列放线菌)，

40、螺旋体(例如钩端螺旋体、梅毒螺旋体)。

41、在一些实施方案中，血液或体液是指来自哺乳动物、尤其是人类的血液或体液。其中，体液(body fluid)根据部位的不同可分为尿液、汗液、脑脊液(cerebrospinal fluid)、浆膜腔液(serous cavity fluid)、关节滑膜液(synovial fluid)等。正常人体上述体液均有少量存在。浆膜腔中积液包括胸腔积液(pleural effusion)、腹腔积液(ascites)和心包积液(pericardial effusion)，关节腔中的积液为滑膜液(joint effusion)。

42、通用合成方法

43、本发明化合物可通过本领域的通用方法合成得到。示例性地，本发明的苯并噻唑类化合物可以通过以下方法合成：首先由未取代或取代的甲基苯并噻唑开始，使其与r2x(x为f、cl、br或i)加热回流反应，得到季铵盐形式的中间物i。随后将连接分子4-羟基间苯二甲醛与所述中间物i加热回流反应(所述中间物i与4-羟基间苯二甲醛的摩尔比大于或等于2)，使得中间体i与连接分子缩合，得到本发明的苯并噻唑类化合物。

44、当r2为c1-18直链或支链亚烷基-磺酸基时，中间物i也可以通过以下方法合成：由未取代或取代的甲基苯并噻唑等原料开始，使其与合适的磺内酯通过开环反应获得中间物i。

45、以上方法适合于r1和r2相同的情况。

46、当r1和r2不相同时，本发明的苯并噻唑类化合物可以通过以下示例性的方法合成：将r1或r2取代的甲基苯并噻唑与连接分子4-羟基间苯二甲醛加热回流反应(4-羟基间苯二甲醛与r1或r2取代的甲基苯并噻唑的摩尔比大约为2)，得到含甲酰基的中间物i’；使所得中间物i’与r2或r1取代的甲基苯并噻唑发生缩合反应，得到本发明的苯并噻唑类化合物。

47、上述方法中，各中间物或产物可通过本领域公知的分离纯化技术回收，以达到需要的纯度。

48、上述方法中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料制备得到。

49、术语定义

50、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

51、如本文中所使用的，术语“c1-18直链或支链烷基”是指含有1-18个碳原子的直链或支链烷烃去掉一个氢原子后得到的基团，其具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、叔丁基、异丁基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基。

52、如本文中所使用的，“c1-6烷基”是指含有1-6个碳原子的直链或支链烷烃去掉一个氢原子后得到的基团，其具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、叔丁基、异丁基等。

53、如本文中所使用的，“c1-6直链烷基”是指含有1-6个碳原子的直链烷烃去掉一个氢原子后得到的基团，其具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基。

54、c1-18直链或支链亚烷基是指含有1-18个碳原子的直链或支链烷烃去掉两个氢原子后得到的基团，其具体实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基等。术语“c1-6直链亚烷基”是指含有1-6个碳原子的直链烷烃去掉两个氢原子后得到的基团。

55、如本文中所使用的，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

56、如本文中所使用的，术语“卤代”是指基团或化合物上的氢被一个或多个卤素原子取代，包括全卤代和部分卤代。

57、如本文中所使用的，术语“c1-6烷氧基”是指，以c1-6烷基-o-方式形成的基团。

58、如本文中所使用的，术语“溶剂化物”(或“溶剂合物”)是指化合物与有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇、乙腈等)分子缔合形成的物质。

59、如本文中所使用的，术语“水合物”是指化合物与水分子缔合形成的物质。

60、如本文中所使用的，术语“晶型”是指物质的晶体结构。物质在结晶时由于受各种因素影响，使分子内或分子间键合方式发生改变，致使分子或原子在晶格空间排列不同，形成不同的晶体结构。本发明化合物可以一种晶体结构存在，也可以多种晶体结构存在，即具有“多晶型”。本发明化合物可以不同的晶型存在。

61、如本文中所使用的，术语“立体异构体”包括构象异构体和构型异构体，其中所述构型异构体主要包括顺反异构体和旋光异构体。本发明化合物可以以立体异构体的形式存在，并因此涵盖所有可能的立体异构体形式，及其任何组合或任何混合物。例如单一对映异构体，单一非对映异构体或以上的混合物。当本发明化合物含有烯烃双键时，除非特别说明，否则其包括顺式异构体和反式异构体，以及其任何组合。

62、本发明所述的化合物可以以互变异构体形式存在，其通过一个或多个双键位移而具有不同的氢的连接点。例如，酮和它的烯醇形式是酮-烯醇互变异构体。应当理解，本发明包含所有化合物的酮-烯醇式互变异构体。各互变异构体及其混合物都包括在本发明的范围中。

63、发明的有益效果

64、与现有技术相比，本发明的荧光染料具有以下一个或多个有益效果：

65、1、相比于现有染料，本发明的染料的热稳定性有较明显的改善；

66、2、染料用于细胞染色需要较高的细胞穿透力，相比于现有染料，本发明的染料具有高的生物穿透力，更适合用于细胞染料及成像；

67、3、本发明的染料可以特异性地与dna结合，有利于对dna的特异性识别和精确测量；

68、4、本发明的染料具有良好的活细胞通透性，能够在不破坏细胞膜的情况下进入细胞对核酸进行染色，毒性小且致癌性低；

69、5、本发明的染料的激发光为波长较小的蓝绿色光，能够识别微小颗粒，提高了对小粒子的检测能力；

70、6、本发明的染料能够使用普通绿色半导体激光器作为光源，大大降低了使用成本；

71、7、本发明的染料结构简单，制备其的原料易得，合成产率高，易于实现产业化。

72、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。