糖蛋白的糖链的制备方法、试剂盒及装置与流程

糖蛋白的糖链的制备方法、试剂盒及装置
1.本技术是申请日为2016年9月27日、申请号为201680056262.7、发明名称为“糖蛋白的糖链的制备方法、试剂盒及装置”的申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种制备糖蛋白的糖链的方法、试剂盒及装置。更具体而言，涉及一种从糖蛋白快速制备糖链的方法。本技术主张基于2015年10月9日于日本技术的日本专利申请2015-201064号、2015年10月20日于日本技术的日本专利申请2015-206262号、2016年1月21日于日本技术的日本专利申请2016-009908号、2016年3月18日于日本技术的日本专利申请2016-055369号及2016年4月18日于日本技术的日本专利申请2016-082675号的优先权，并将其内容援用于此。


背景技术：

3.为了从糖蛋白制备游离糖链，已知一种通过与糖链有特异结合的载体捕集糖蛋白释放出的糖链而回收糖链的方法。例如，专利文献1中公开了一种糖蛋白糖链的分析方法，该方法包括：得到载有糖蛋白的固相(具体而言，在电泳中所使用的电泳凝胶或印迹膜)的工序；通过糖链释放装置对该固相进行处理的工序；使释放出的糖链从该固相溶出而得到含糖链的溶液的工序；使含该糖链的溶液和与其具有特异结合的捕集载体接触而将糖链捕集至该捕集载体上的工序，去除未与该捕集载体结合的糖链以外的物质的工序；使结合于捕集载体的糖链再释放而得到纯化后的糖链试样的工序，和对糖链进行分析的工序。该方法中，通过与加标签的试剂的交换反应进行糖链的再释放。
4.以往技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本特开2009-156587号公报。


技术实现要素：

7.在如专利文献1那样使用电泳的情况下，为了检测出被电泳分离的糖蛋白，需要进行如下工序，即通过在凝胶上进行同位素标记或染色而将糖蛋白的带可视化，或者转印到膜片上之后通过抗原抗体反应或染色而可视化。如此进行糖蛋白的分离需要较多的时间。而且，由于用于可视化的成分混合在糖蛋白中，所以会对释放糖链的酶反应造成影响，或者混入到释放后的糖链试样中。因此，为了得到糖链就需要对这些成分进行分离，从而需要更多的时间。进一步，为了得到糖链来作为附加有适合糖链分析的标记基团的修饰物，要在糖链暂时从蛋白分离之后进行标记工序。正如此，为了从糖蛋白得到糖链作为修饰物，就需要非常多的时间。
8.另外，已知有一种能够与糖蛋白结合而将其固定的固相(例如，特异捕集抗体的蛋白a琼脂糖凝胶)，但这种固相专门用于糖蛋白的纯化。即，这种固相用于捕集糖蛋白而将其从混杂物分离，然后使捕集到的糖蛋白再次从固相释放。因为是对如此纯化后的糖蛋白进
行使糖链从糖蛋白释放的工序，因此为了得到糖链也需要时间。
9.另一方面，由糖蛋白制备糖链时，一般要求快速化。鉴于此，本发明的目的在于提供一种由糖蛋白快速制备标记过的糖链的技术。
10.本发明包括以下方案。
11.[1]一种制备糖蛋白的糖链的方法，该方法包括：释放工序，在容器内使糖链释放酶与包含被固定在固相的糖蛋白的试样发生作用而得到含糖链的游离生成物；及标记工序，向所述容器内的所述游离生成物中添加标记试剂，从而得到含所述糖链的标记物的标记生成物。
[0012]
[2]根据[1]所述的制备糖蛋白的糖链的方法，该方法在所述释放工序之前还具备使所述试样与含表面活性剂的预处理剂接触的预处理工序。
[0013]
[3]根据[1]或[2]所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，在含有酸衍生型阴离子表面活性剂的脱糖链促进剂的存在下，进行所述释放工序。
[0014]
[4]根据[3]所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述酸衍生型阴离子表面活性剂选自由羧酸型阴离子表面活性剂、磺酸型阴离子表面活性剂、硫酸酯型阴离子表面活性剂和磷酸酯型阴离子表面活性剂组成的群中。
[0015]
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，在开放体系且加热条件下进行所述释放工序。
[0016]
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述糖蛋白为抗体、激素、酶或包含这些的复合物。
[0017]
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述固相选自由阳离子交换载体、疏水性相互作用载体和无机载体组成的群中。
[0018]
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述糖蛋白为抗体，所述固相的表面具有从蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白h、蛋白d、蛋白arp组成的群中选出的配体。
[0019]
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述标记试剂含有2-氨基苯甲酰胺、还原剂及溶剂。
[0020]
[10]根据[9]所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述还原剂为甲基吡啶硼烷。
[0021]
[11]根据[9]或[10]所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述溶剂含有质子性化合物。
[0022]
[12]根据[11]所述的制备糖蛋白的糖链的方法，其中，所述溶剂还含有沸点比所述质子性化合物高的非质子性化合物。
[0023]
[13]根据[1]至[12]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的方法，该方法在所述释放工序之后还包括通过固液分离而得到含有所述游离生成物的分离液的分离工序。
[0024]
[14]根据[1]至[12]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的方法，该方法在所述标记工序之后还包括通过固液分离而得到含有所述糖链的标记物的分离液的分离工序。
[0025]
[15]一种制备糖蛋白的糖链的试剂盒，该试剂盒具备用于固定糖蛋白的固相、用于承载所述固相以便进行糖链的释放和标记的容器及糖链释放酶。
[0026]
[16]根据[15]所述的制备糖蛋白的糖链的试剂盒，该试剂盒还具备含表面活性剂
的预处理剂、含有酸衍生型阴离子表面活性剂的脱糖链促进剂、或标记试剂。
[0027]
[17]根据[16]所述的制备糖蛋白的糖链的试剂盒，其中，所述标记试剂含有2-氨基苯甲酰胺、还原剂及溶剂。
[0028]
[18]根据[15]至[17]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的试剂盒，其中，所述固相选自由阳离子交换载体、疏水性相互作用载体和无机载体组成的群中。
[0029]
[19]根据[15]至[18]中任一项所述的制备糖蛋白的糖链的试剂盒，其中，所述固相的表面具有从蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白h、蛋白d、蛋白arp组成的群中选出的配体。
[0030]
[20]一种制备糖蛋白的糖链的装置，该装置具备对收纳含有被固定在固相的糖蛋白的试样的容器进行支撑的容器支撑部和向所述容器导入试剂的试剂导入部，所述试剂导入部包括向所述容器导入糖链释放酶的糖链释放酶导入部和向所述容器导入标记试剂的标记试剂导入部。
[0031]
[21]根据方案20所述的制备糖蛋白的糖链的装置，该装置还具备对所述容器的收纳物进行固液分离的固液分离部。
[0032]
[22]根据方案20或21所述的制备糖蛋白的糖链的装置，该装置还具备对所述容器的收纳物的温度进行调节的温度调节部。
[0033]
根据本发明，能够提供一种由糖蛋白快速制备标记过的糖链的技术。
附图说明
[0034]
图1是在比较例1中得到的hplc图谱。
[0035]
图2是在实施例1中得到的hplc图谱。
[0036]
图3是在实施例2中得到的hplc图谱。
[0037]
图4是在实施例3中得到的hplc图谱。
[0038]
图5是在参考例1中得到的hplc图谱。
[0039]
图6是在实施例4中得到的hplc图谱。
[0040]
图7是对比较例1、参考例1及实施例3中得到的hplc图谱的峰面积比率进行比较的柱状图。
[0041]
图8是在实施例5中得到的hplc图谱。
[0042]
图9是在实施例6中得到的hplc图谱。
[0043]
图10是在实施例7中得到的hplc图谱。
[0044]
图11是分别表示实施例5～7的hplc图谱的峰面积值的总和的柱状图。
[0045]
图12是在实施例8(乙酸浓度40体积％)至实施例11(乙酸浓度70体积％)中得到的hplc图谱。
[0046]
图13是在实施例7(乙酸浓度75体积％)及实施例12(乙酸浓度80体积％)至实施例14(乙酸浓度95体积％)中得到的hplc图谱。
[0047]
图14是表示实施例7～14的hplc图谱的峰面积值的总和与乙酸浓度的关系的柱状图。
[0048]
图15是在实施例15中得到的hplc图谱。
[0049]
图16是表示在实施例15中得到的hplc图谱的峰面积值的总和与反应时间的关系的柱状图。
[0050]
图17是在比较例2中得到的hplc图谱。
[0051]
图18是在比较例3中得到的hplc图谱。
[0052]
图19是在参考例2中得到的hplc图谱。
[0053]
图20是在实施例16中得到的hplc图谱。
[0054]
图21是在实施例17中得到的hplc图谱。
[0055]
图22是表示图21中的峰的总面积的柱状图。
[0056]
图23是在实施例18中得到的hplc图谱。
[0057]
图24是表示制备糖蛋白的糖链的装置的一个示例的示意图。
[0058]
其中，符号说明如下。
[0059]
100：制备糖蛋白的糖链的装置；10：固相；15：容器；16：回收容器；20：容器支撑部；30：试剂导入部；31：糖链释放酶；32：标记试剂；33：预处理剂/脱糖链促进剂；34：罐；35：糖链释放酶导入部(标记试剂导入部)；35a：输送管；36、37、38：阀；40：固液分离部；41：支架；42：驱动轴；43：马达；50：容器输送部(液体输送部)；60：温度调节部。
具体实施方式
[0060]
在一实施方式中，本发明提供一种制备糖蛋白的糖链的方法，该方法包括：释放工序，在容器内使糖链释放酶(糖链分解酶)作用于含有被固定在固相的糖蛋白的试样，从而得到含糖链的游离生成物；及标记工序，向所述容器内的所述游离生成物中添加标记试剂，从而得到含所述糖链的标记物的标记生成物。
[0061]
根据本实施方式的方法，不使被固定在固相的糖蛋白溶出而在固相上进行糖链释放，并且不用分离游离生成物而直接添加标记试剂(标记反应液)，由此能够以分析用试样的形态(标记过的形态)由糖蛋白非常快速地制备糖链。
[0062]
另外，在本实施方式的方法中，供给到释放工序的糖蛋白被固定在固相。该情况下的固定形态包括基于特异结合的非共价结合(氢键及离子键)及共价键，不包括例如通过处理至电泳凝胶或转印至印迹膜而仅被支持着的形态。
[0063]
[释放工序]
[0064]
在释放工序中，使糖链释放酶作用于被固定在固相的糖蛋白以释放糖链，从而得到游离生成物。优选，使糖链释放酶在脱糖链促进剂的存在下发挥作用。本工序实质上不包括因化学片段化或酶片段化等而引起的蛋白的片段化工序。
[0065]
(包含被固定在固相的糖蛋白的试样)
[0066]
＜＜糖蛋白＞＞
[0067]
糖蛋白只要是至少包含糖链作为复合组分的蛋白即可。糖蛋白的糖链部分可以是n-连接型，也可以是o-连接型。并且，糖链部分可以具有天然结构，也可以是人工改造的。并且，糖链部分可以是中性糖链，也可以是酸性糖链。并且，糖蛋白中的糖链结合部位可以与天然产物的部位相同，也可以是天然产物中未连接糖链的部位。
[0068]
在改性前的状态下，糖蛋白的蛋白部分可以折叠而使糖链部分并入其内部。这种蛋白部分的分子量例如可以是1kda以上，也可以是10kda以上。蛋白部分的分子量范围内的上限并无特别限定，例如可以是1000kda。
[0069]
作为具体的糖蛋白，例如可列举选自抗体、激素、酶及包含它们的复合物中的生理
活性物质。在此，作为复合物，可列举抗原与抗体的复合物、激素与受体的复合物、酶与基质的复合物等。因为这些糖蛋白是通过细胞培养工程制备的生理活性物质，因此所得到的糖链部分呈不均匀的状态，这对缩短糖链分析时间意义重大。
[0070]
另外，当糖蛋白包含抗体时，糖链解析的重要性特别高。该情况下，能够使对抗体活性等有影响的糖链快速释放。作为抗体，可列举igg、igm、iga、igd、ige等免疫球蛋白；fab、f(ab’)、f(ab’)2、单链抗体(scfv)、双特异性抗体(diabody)等低分子抗体；通过fc区域与其他功能蛋白或肽的融合而构建的fc融合蛋白或肽等含fc的分子；附加有放射性同位素配位螯合物、聚乙二醇等化学修饰基的化学修饰抗体等。并且，抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
[0071]
另外，抗体可以是抗体候选药物或抗体药物。抗体候选药物是处于抗体药物的研发阶段的物质，且是用于作为抗体药物的活性及安全性等的评价的物质。基于抗体候选药物进行糖链释放时，能够加快抗体药物的研发，且基于抗体药物进行糖链释放时，能够加快抗体药物的品质管理。
[0072]
＜＜固相＞＞
[0073]
在本实施方式的方法中，糖蛋白被固定在固相。作为固定的形态，包括基于特异结合的非共价结合(氢键及离子键)及共价结合，不包含例如通过处理至电泳凝胶或转印至印迹膜而仅被支持着的形态。当通过非共价结合而固定时，优选，结合速率常数ka(单位m-1
s-1
)具有例如103以上、例如104以上、例如103～105、例如104～105的亲和性。
[0074]
对于固定有糖蛋白的固相，只要其是表面具有以非共价结合或共价键结合方式与糖蛋白的蛋白部分连接的链接位点的载体，则并无特别限定。
[0075]
作为载体表面所具有的链接位点，例如可列举能够捕集糖蛋白的蛋白部分的配体。作为配体，可列举与糖蛋白的蛋白部分具有亲和性的分子(以下，有时简称为与糖蛋白具有亲和性的分子。)、在表面化学修饰有离子交换基团或疏水性基团的载体。
[0076]
与糖蛋白具有亲和性的分子并无特别限定，本领域技术人员能够根据应捕集的糖蛋白而轻松地进行确定。例如，肽型或蛋白型配体、适体(能够与糖蛋白特异结合的合成dna、合成rna或肽)、化学合成型配体(噻唑衍生物等)。
[0077]
例如，当糖蛋白为抗体时，与糖蛋白具有亲和性的分子可以是与作为抗体或抗体的恒定区域的含fc的分子有特异结合的分子。更具体而言，作为肽型或蛋白型配体，可列举：蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白h、蛋白d、蛋白arp等源自微生物的配体；通过这些配体的重组表达而得到的功能变体(类似物)；抗体的fc受体等重组蛋白等。由此，关于糖链解析的重要性特别高的抗体，能够制备生产率高的糖链试样，且能够对其进行分析。
[0078]
对于离子交换基团，只要其是能够通过离子交换作用捕集糖蛋白并且能够借助抗衡离子以取决于离子强度的方式脱出糖蛋白的官能团，则并无特别限定。优选，列举羧基(更具体而言，羧甲基等)、磺酸基(更具体而言，磺乙基、磺丙基等)等阳离子交换基团，也可以是季氨基等阴离子交换基团。
[0079]
作为疏水性基团，例如可列举碳原子数2～8的烷基或芳基。更具体而言，可列举丁基、苯基、辛基等，这些基团可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
[0080]
作为载体表面所具有的链接位点，除了上述以外，还可以是与作为糖蛋白的蛋白部分的构成要件的c末端氨基酸残基的c末端共价结合的连接基团。作为这种连接基团，可
列举由在肽固相合成中所使用的作为固相表面修饰试剂的含氨基化合物衍生而来的连接基团。
[0081]
载体可以是不溶于水的基材，只要能够固定上述链接位点，则无特别限制，有机载体、无机载体及它们的复合载体。作为有机载体，可列举由如下物质构成的载体：交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子；交联琼脂糖凝胶、结晶纤维素、交联纤维素、交联直链淀粉、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类。它们可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。作为无机载体，可列举玻璃珠、硅胶、单片二氧化硅等。
[0082]
有机载体具有容易含水的性质，相对于此，无机载体不易含水。本实施方式的方法中，为了便于在固相上进行各种反应，优选使用不易含水的无机载体，因为这样就不会使酶和/或试剂的效果被冲淡。防止冲淡酶和/或试剂的效果有助于防止在分析中检测到多余的信号。因此，载体优选为无机载体。并且，若载体为无机载体时，例如载体的一部分就不会在糖链释放酶作用下释放，且在使用了源自糖的树脂的情况下，不会从一开始就发生树脂中残留的糖的溶出。因此，在被释放的糖链的分析中，可轻松地抑制多余信号的出现。
[0083]
对载体的形状并无特别限定，可以是粒状，也可以是非粒状。当为粒状载体(珠子)时，可以是多孔载体。当为粒状载体时，平均粒径例如可以是1～100μm。从通液性的观点考虑，优选平均粒径为上述下限值以上，且从防止理论塔板(theoretical plate)减少的方面考虑，优选为上述上限值以下。
[0084]
作为非粒状载体，可列举单片类型硅胶及膜体等。单片类型硅胶为具有微米尺寸的三维网状细孔(微孔)和纳米尺寸的细孔(介孔)的硅胶的聚集体。微孔的直径例如可以是1～100μm，也可以是1～50μm，也可以是1～30μm，也可以是1～20μm。从通液性的方面考虑，优选微孔为上述下限值以上，且从防止理论塔板减少的观点考虑，优选为上述上限值以下。介孔的直径例如可以是1～100nm，也可以是1～50nm。由此，能够有效地捕集糖。
[0085]
载体的使用体积(为粒状载体时，载体本身的体积还包括填充时的空隙的体积；为非粒状载体时，载体本身的体积还包含介孔及微孔的体积)例如可以是0.001～0.1cm3，例如可以是0.001～0.01cm3。从防止理论塔板减少的方面考虑，优选为上述下限值以上，且从通液性的方面考虑，优选为上述上限值以下。并且，通过设为上述体积，还可轻松地以适合hplc分析的浓度得到溶出后的分离液。
[0086]
固相可以以填充在管柱、多孔板的各个孔、过滤板的各个孔、微型管等容器中的状态下使用。
[0087]
(含有被固定在固相的糖蛋白的试样的制备)
[0088]
含有被固定在固相的糖蛋白的试样例如能够通过使含糖蛋白的试样与上述固相接触而进行捕集来得到。从快速进行糖链制备的观点考虑，含有要与固相接触的糖蛋白的试样可以是未进行糖蛋白纯化(将糖蛋白从其混杂物分离)的试样。例如，可列举血液(例如，血清、血浆)、淋巴液、腹腔浸出液、组织间液、脑脊髓液、腹水等体液；b细胞、杂交瘤、cho细胞等产生抗体的细胞的培养上清；移植了产生抗体的细胞的动物的腹水等。如培养上清等细胞培养工程糖蛋白的制备物那样，试样可以是蛋白部分均匀而糖链部分非均匀的糖蛋白变异的混合物。
[0089]
除了上述以外，含有被固定在固相的蛋白的试样还可以是通过糖蛋白的固相合成而得到的生成物。
[0090]
含有要与固相接触的糖蛋白的试样中的糖蛋白的浓度并无特别限定，例如，可以是0.1μg/ml～50mg/ml。从检测方面考虑，优选为上述下限值以上，且从定量性的方面考虑，优选为上述上限值以下。
[0091]
要与固相接触的糖蛋白在每一个容器中可以是0.001μg～100mg，也可以是0.001μg～5mg。从检测方面考虑，优选糖蛋白的量为上述下限值以上。本实施方式的方法，其工序数少且试样的损失非常少，因此在糖蛋白为小比例(尤其0.001～500μg)时尤为有用。从定量性的方面考虑，优选糖蛋白的量为上述上限值以下。
[0092]
对于含有被固定在固相的糖蛋白的试样，可以预制成使被固定在固相的糖蛋白分散在液体成分中的状态，也可以预制成液体成分被分开的状态。
[0093]
另外，在使含有上述糖蛋白的试样与固相接触并在糖蛋白的捕集结束的时刻或固相合成结束的时刻，得到包含混杂物的含有被固定在固相的糖蛋白的试样。作为混杂物，可列举在含有要固定于固相的糖蛋白的试样中所包含的成分、在糖蛋白的固相合成中所使用的试剂等，更具体而言，可列举盐、低分子化合物、蛋白(对该固相不具有结合性的蛋白)及其他生物分子。
[0094]
因此，在糖蛋白的捕集结束之后或固相合成结束之后，可以对含有被固定在固相的糖蛋白的试样进行清洗处理。由此，能够在将糖蛋白固定在固相的状态下直接去除混杂物。清洗能够通过将清洗液通入固相来进行。作为通液的方法，可列举自然下落、吸引、加压、离心等方法。
[0095]
可由本领域技术人员适当选择具有不切断糖蛋白的蛋白部分与固相表面的链接位点的结合的液体性质及组成的物质作为清洗液。具体而言，可以是缓冲液及其他水溶液或水。当使用水溶液时，优选ph为5～10。若水溶液的ph在该范围内，则可轻松地确保在后续工序中所使用的糖链释放酶的活性。并且，当糖蛋白通过非共价结合而被固定在固相时，会轻松地防止糖蛋白的释放。当使用缓冲液时，作为缓冲剂，可列举碳酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、柠檬酸二铵、氨基甲酸铵等铵盐；三羟甲基铵等tris缓冲剂；磷酸盐等。
[0096]
(容器)
[0097]
在容器内预制含有被固定在固相的糖蛋白的试样。基于效率方面的考虑，优选在容器内制备固定在固相的糖蛋白。容器只要能够承载液体及固相且能在承载固相的状态下分离液体(通液)即可，并无特别限定，例如可列举管柱、多孔板的各个孔、过滤板的各个孔、微型管等。
[0098]
(糖链释放酶)
[0099]
作为作用于糖蛋白的糖链释放酶，可列举肽n-聚糖酶(pngase f、pngase a)、endo-β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(endo-h、endo-f、endo-a、endo-m)等。
[0100]
糖链释放酶可以预制成分散在水或缓冲液中的状态。当使用缓冲液时，作为缓冲剂，可列举碳酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、柠檬酸二铵、氨基甲酸铵等。优选，缓冲液的ph为5～10。若缓冲液的ph在该范围内，则轻松地确保糖链释放酶的活性。水或缓冲液可以在糖链释放酶的基础上含有金属盐等盐类、甘油等蛋白的稳定剂等成分。
[0101]
(脱糖链促进剂)
[0102]
释放工序可以在脱糖链促进剂的存在下进行。由此，能够提高从糖蛋白回收糖链试样的回收率。优选，脱糖链促进剂含有酸衍生型阴离子表面活性剂。在酸衍生型阴离子表
面活性剂的作用下，糖蛋白的蛋白部分发生改性进而三维结构产生变化，从而糖链释放酶更易作用于分解靶位点。由此，糖部分轻松地分解而被释放。
[0103]
酸衍生型阴离子表面活性剂是由有机酸衍生而来的阴离子表面活性剂。例如，可列举羧酸型阴离子表面活性剂、磺酸型阴离子表面活性剂、硫酸酯型阴离子表面活性剂、磷酸酯型阴离子表面活性剂等。其中，优选羧酸型阴离子表面活性剂。因为，若酸衍生型阴离子表面活性剂为羧酸型阴离子表面活性剂时，被认为具有使糖蛋白的蛋白部分改性而不易使糖链释放酶改性的趋势。
[0104]
＜＜酸衍生型阴离子表面活性剂-羧酸型阴离子表面活性剂＞＞
[0105]
作为羧酸型阴离子表面活性剂，可列举由r
1-coox(其中，r1表示有机基团，x表示氢原子或阳离子。)表示的羧酸及羧酸盐、以及由r1con(r2)-r
3-coox(其中，r1表示有机基团，-n(r2)-r
3-coo-表示氨基酸残基，x表示氢原子或阳离子。)表示的氨基酸及其盐(n-酰基氨基酸类表面活性剂)等。其中，优选由r1con(r2)-r
3-coox(其中，r1表示有机基团，-n(r2)-r
3-coo-表示氨基酸残基，x表示氢原子或阳离子。)表示的氨基酸及其盐(n-酰基氨基酸类表面活性剂)。
[0106]
作为阳离子x，可列举钠、钾等碱金属离子、三乙醇胺离子、铵离子等。另外，在以下所有的酸衍生型阴离子表面活性剂的例示中，关于“盐”，至少包括示例物质的钠盐、钾盐、三乙醇胺盐、铵盐。
[0107]
＜＜羧酸型阴离子表面活性剂-羧酸及羧酸盐＞＞
[0108]
由r
1-coox表示的羧酸盐中，有机基团r1为至少具有碳的基团，可列举高级烷基、高级不饱和烃基、掺杂有氧化烯基的烃基、氟取代的高级烷基。
[0109]
高级烷基及高级不饱和烃基的碳原子数可以是6～18。作为具有这种高级烷基或高级不饱和烃基的羧酸型阴离子表面活性剂的具体例，可列举辛酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、亚油酸盐等。并且，上述高级烷基及高级不饱和烃基可以被取代，取代基可以是碳原子数例如为1～30的烷基或烷氧基羰基。
[0110]
掺杂有氧化烯基的烃基中，主链可以含有一个以上的氧化烯基。关于氧化烯基，可列举氧化亚乙基、氧化正亚丙基、氧化亚异丙基等。作为掺杂有氧化烯基的烃基，例如可列举由r
4-(ch2ch2o)
n-r
5-表示的基团。
[0111]
其中，r4可以是高级烷基、高级不饱和烃基、或者取代或未取代的芳基。高级烷基及高级不饱和烃基的碳原子数可以是6～18。作为芳基，可列举苯基、萘基等。当为取代芳基时，取代基可以是直链或分叉烷基，且该直链或分叉烷基的碳原子数可以是1～30。尤其为苯基时，该取代基可以在与磺酰基相对于的对位被取代。并且，n可以是1～10。并且，r5可以是西格玛键或亚乙基、亚甲基、正丙基等亚烷基。作为这种羧酸盐的具体例，可列举月桂醇聚醚羧酸盐(例如，月桂醇聚醚-4-羧酸盐、月桂醇聚醚-6-羧酸盐)十三烷醇聚醚羧酸盐(例如，十三烷醇聚醚-4-羧酸盐、十三烷醇聚醚-6-羧酸盐)等。
[0112]
氟取代的高级烷基中，一个以上的氢原子被氟原子取代。氟取代的高级烷基可以是所有的氢原子被氟取代的全氟烷基。并且，碳原子数可以是6～18。作为这种全氟烷基羧酸及全氟烷基羧酸盐的具体例，可列举全氟辛酸、全氟壬酸、全氟辛酸盐、全氟壬酸盐等。
[0113]
＜＜羧酸型阴离子表面活性剂-氨基酸及其盐＞＞
[0114]
由r1con(r2)-r
3-coox表示的氨基酸或其盐中，有机基团r1及阳离子x与上述羧酸
或羧酸盐中的有机基团r1及阳离子x相同。
[0115]
并且，r2为氢原子或烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基等)。r3可以是取代或未取代的亚乙基、亚甲基、正丙基等，也可以与n末端侧的氮原子一起形成环。从而，由-n(r2)-r
3-coo-表示的氨基酸残基可以是α-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基等，也可以是源自天然氨基酸的残基，也可以是源自非天然氨基酸的残基。例如，可列举肌氨酸残基、谷氨酸残基、甘氨酸残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、β-丙氨酸残基等源自氨基酸的残基。
[0116]
作为r2为氢原子情况下的该氨基酸或其盐(即n-酰基氨基酸类表面活性剂)的具体例，可列举n-月桂酰天冬氨酸盐、n-月桂酰谷氨酸、n-月桂酰谷氨酸盐、n-肉豆蔻酰谷氨酸盐、n-椰油酰丙氨酸盐、n-椰油酰甘氨酸盐、n-椰油酰谷氨酸盐、n-棕榈酰谷氨酸盐、n-棕榈酰脯氨酸、n-棕榈酰脯氨酸盐、n-十一碳烯酰基甘氨酸、n-十一碳烯酰基甘氨酸盐、n-硬脂酰谷氨酰胺盐等。若酸衍生型阴离子表面活性剂为n-酰基氨基酸类表面活性剂，则具有更轻松地使糖蛋白的蛋白部分改性而不易使糖链释放酶改性的趋势。
[0117]
作为当r2为烷基的情况下的该氨基酸或其盐(即，n-酰基-n-烷基氨基酸类表面活性剂)的具体例，可列举n-椰油酰基-n-甲基丙氨酸、n-椰油酰基-n-甲基丙氨酸盐、n-肉豆蔻酰基-n-甲基-β-丙氨酸、n-肉豆蔻酰基-n-甲基-β-丙氨酸盐、n-肉豆蔻酰基肌氨酸盐、n-月桂酰基-n-甲基丙氨酸、n-月桂酰基-n-甲基丙氨盐、n-月桂酰基-n-乙基甘氨酸、n-月桂酰基-n-异丙基甘氨酸盐、n-月桂酰基-n-甲基-β-丙氨酸、n-月桂酰基-n-甲基-β-丙氨酸盐、n-月桂酰基-n-乙基-β-丙氨酸、n-月桂酰基-n-乙基-β-丙氨酸盐、n-月桂酰基肌氨酸、n-月桂酰基肌氨酸盐、n-椰油酰基肌氨酸、n-椰油酰基肌氨酸盐、n-油酰基-n-甲基-β-丙氨酸、n-油酰基-n-甲基-β-丙氨酸盐、n-油酰基肌氨酸、n-油酰基肌氨酸盐、n-亚油酰基-n-甲基-β-丙氨酸、n-棕榈酰基-n-甲基-β-丙氨酸、n-棕榈酰基肌氨酸盐等。若酸衍生型阴离子表面活性剂为n-酰基-n-烷基氨基酸类表面活性剂，则具有进一步轻松地使糖蛋白的蛋白部分改性而不易使糖链释放酶改性的趋势。
[0118]
＜＜酸衍生型阴离子表面活性剂-磺酸型阴离子表面活性剂＞＞
[0119]
磺酸型阴离子表面活性剂为由r
1-so3x(其中，r1表示有机基团，x表示氢原子或阳离子。)表示的磺酸或磺酸盐。有机基团r1为至少具有碳的基团，可列举高级烷基、高级不饱和烃基、掺杂有氧化烯基的烃基、氟取代的高级烷基、取代或未取代的芳基、掺杂有二价连接基团(例如，-o-、-co-、-conh-、-nh-等)的高级烷基或高级不饱和烃基等。
[0120]
关于有机基团r1中的高级烷基、高级不饱和烃基、掺杂有氧化烯基的烃基、氟取代的高级烷基及阳离子x，与上述羧酸或羧酸盐中的有机基团r1及阳离子x相同。
[0121]
具体而言，可列举1-己烷磺酸盐、1-辛烷磺酸盐、1-癸烷磺酸盐、1-十二烷磺酸盐；全氟丁烷磺酸、全氟丁烷磺酸盐、全氟辛烷磺酸、全氟辛烷磺酸盐；十四烷磺酸盐；α磺基脂肪酸甲酯盐(ch3(ch2)nch(so3x)cooch3)等(n为1～30的整数)。
[0122]
当有机基团r1为取代或未取代的芳基时，作为芳基，可列举苯基、萘基等。当为取代芳基时，取代基可以是直链或分叉烷基，该直链或分叉烷基的碳原子数可以是1～30。尤其为苯基时，该取代基可以在与磺酰基相对的对位被取代。作为这种芳香族类磺酸盐，可列举甲苯磺酸盐、异丙基苯磺酸盐、辛基苯磺酸、十二烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、萘二磺酸酯、萘三磺酸盐、丁基萘磺酸盐等。
[0123]
作为有机基团r1是掺杂有二价连接基团(例如，-o-、-co-、-conh-、-nh-等)的高级
烷基或高级不饱和烃基的情况下的磺酸型表面活性剂，可列举被该高级烷基或高级不饱和烃基o-取代的羟乙基磺酸盐、被该高级烷基或高级不饱和烃基n-取代的牛磺酸盐等。该高级烷基或高级不饱和烃基的碳原子数可以是6～18。作为这种磺酸型表面活性剂的具体例，可列举椰油酰基羟乙基磺酸盐、椰油酰基牛磺酸盐、椰油酰基-n-甲基牛磺酸、n-油酰基-n-甲基牛磺酸盐、n-硬脂酰基-n-甲基牛磺酸盐、n-月桂酰基-n-甲基牛磺酸盐等。
[0124]
＜＜酸衍生型阴离子表面活性剂-硫酸酯型阴离子表面活性剂＞＞
[0125]
硫酸酯型阴离子表面活性剂为由r
1-oso3x(其中，r1表示有机基团，x表示阳离子。)表示的硫酸酯盐。有机基团r1为至少具有碳的基团，且为高级烷基、高级不饱和烃基、掺杂有氧化烯基的烃基、氟取代的高级烷基，且分别与上述羧酸型表面活性剂中的r1相同。作为阳离子x，可列举钠、钾等碱金属离子、三乙醇胺离子、铵离子等。
[0126]
作为硫酸酯盐的具体例，可列举月桂基硫酸盐、肉豆蔻基硫酸盐、月桂醇聚醚硫酸盐(c
12h25
(ch2ch2o)noso3x，其中，n为1～30的整数)、聚氧乙烯烷基苯酚磺酸钠(c8h
17
c6h4o[ch2ch2o]3so3x)等。
[0127]
＜＜酸衍生型阴离子表面活性剂-磷酸酯型阴离子表面活性剂＞＞
[0128]
磷酸酯型阴离子表面活性剂为由r
1-oso3x(其中，r1表示有机基团，x表示氢原子或阳离子。)表示的磷酸酯或磷酸酯盐。有机基团r1为至少具有碳的基团，且为高级烷基、高级不饱和烃基、掺杂有氧化烯基的烃基、氟取代的高级烷基，并分别与上述羧酸型表面活性剂中的r1相同。作为阳离子x，可列举钠、钾等碱金属离子、三乙醇胺离子、铵离子等。
[0129]
作为磷酸酯或磷酸酯盐的具体例，可列举月桂基磷酸酯、月桂基磷酸酯盐等。
[0130]
＜＜脱糖链促进剂的组成＞＞
[0131]
脱糖链促进剂可以预制成在水或缓冲液中中溶解或分散有酸衍生型阴离子表面活性剂的状态。当使用缓冲液时，作为缓冲剂，可列举碳酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、柠檬酸二铵、氨基甲酸铵等铵盐；三羟甲基铵等tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲剂；磷酸盐等。优选，缓冲液的ph为5～10。若缓冲液的ph在该范围内，则轻松地确保糖链释放酶的活性。在脱糖链促进剂中，作为水或缓冲液中所含有的除酸衍生型阴离子表面活性剂以外的成分，可列举除表面活性剂以外的金属盐等盐类。
[0132]
(释放工序的操作及反应条件)
[0133]
在释放工序中，制备满足糖链释放酶的最佳条件(温度及ph)的包含糖蛋白和糖链释放酶的释放反应液即可。
[0134]
当使用脱糖链促进剂时，制备满足糖链释放酶的最佳条件(温度及ph)的包含糖蛋白和酸衍生型阴离子表面活性剂及糖链释放酶的释放反应液即可。因此，当使用脱糖链促进剂时，可以以任意操作顺序混合含有已固定的糖蛋白的试样(以下，有时简称为含糖蛋白的试样。)、脱糖链促进剂及糖链释放酶。
[0135]
例如，可以在相同的时刻将含糖蛋白的试样、脱糖链促进剂及糖链释放酶彼此混合来制备释放反应液。并且，可以先添加脱糖链促进剂，然后添加糖链释放酶来制备释放反应液。进一步，在被固定在固相的糖蛋白是经在后面叙述的预处理而得到的情况下并且在脱糖链促进剂与在预处理中所使用的表面活性剂为相同物质的情况下，在预处理时，可以预先添加相当于脱糖链促进剂分量的表面活性剂并将其追加至相当于预处理剂分量的表面活性剂，继而在释放工序中(由于为已存在脱糖链促进剂的状态)可以仅添加糖链释放
酶。
[0136]
具体而言，将所有的成分进行混合而制成释放反应液，然后设定至最适温度，从而能够进行使糖链从糖蛋白释放的反应。该情况下，反应时间例如可以是5秒钟～24小时。
[0137]
当使用脱糖链促进剂时，可以先将含糖蛋白的试样和酸衍生型阴离子表面活性剂混合以使糖蛋白的蛋白部分改性，然后与糖链释放酶进行混合。该情况下，改性时间例如可以是5秒钟～24小时，糖链释放时间例如可以是5秒钟～24小时。
[0138]
在释放反应液中，糖蛋白的浓度例如可以是0.1μg/ml～100mg/ml，例如可以是1μg/ml～10mg/ml。从检测性的方面考虑，优选释放反应液中的糖蛋白的浓度为上述下限值以上，从定量性的方面考虑，优选为上述上限值以下。
[0139]
当使用脱糖链促进剂时，在释放反应液中，酸衍生型阴离子表面活性剂的浓度例如可以是0.01～30质量％，例如可以是0.2～1.0质量％，例如可以是0.2～0.3质量％，例如可以是0.22～0.27质量％。或者，可以使所使用的酸衍生型阴离子表面活性剂的量相对于糖蛋白1μg成为0.001μg～100mg。
[0140]
将酸衍生型阴离子表面活性剂的使用量设定为上述范围，由此在维持糖链释放酶的活性的方面及游离糖链的回收量的方面更好，并且在回收量的稳定性方面也更好。另外，例如通过固相载体进行游离糖链的纯化时，在防止干燥时间冗长的层面上，也优选。
[0141]
在释放反应液中，糖链释放酶的浓度例如可以是0.001μu/ml～1000mu/ml，例如可以是0.01μu/ml～100mu/ml。或者，可以使所使用糖链释放酶的量相对于糖蛋白1μg成为0.001μu～1000mu。将糖链释放酶的使用量设定为上述范围，能够进行有效的糖链释放。
[0142]
反应ph只要对应于糖链释放酶的最适ph即可，例如可以是5～10。反应温度也对应于糖链释放酶的最适温度即可，例如可以是4～90℃。
[0143]
反应时间根据糖蛋白的规模等而不同，例如可以是5秒钟～24小时。优选，将释放工序的反应体系设为开放体系进行加热以使溶剂蒸发。作为加热温度，例如可以是40℃以上，例如也可以是45℃以上。由此，因为在释放工序的进行中溶剂蒸发而反应液的浓度逐渐上升，所以无论供给至本实施方式的方法的糖蛋白的规模如何，都可轻松地提供有效进行糖链释放的浓度。而且，因为同时进行释放反应和溶剂去除，所以缩短了或省去了用于与释放工序分开进行溶剂去除工序的时间，进而能够快速制备糖链。作为加热温度的范围内的上限，从防止糖链释放酶的改性的观点考虑，例如可以是80℃。
[0144]
(游离生成物)
[0145]
通过释放工序而得到的游离生成物包含释放后的糖链和结合于固相的蛋白。对于结合于固相的蛋白，构成糖蛋白的蛋白部分中的氨基酸残基之间的肽键未被切断。可以以包含溶剂的状态得到游离生成物，而尤其是给释放工序提供开放体系及加热条件时，也可以以溶剂完全蒸发的蒸发干燥固体物的状态得到游离生成物。
[0146]
本实施方式的方法中，糖链被释放，而蛋白部分始终被固定在固相，因此仅通过分离该固相即可去除蛋白部分。另一方面，对分离固相而得到的分离液是同时溶解有被释放的糖链和在预处理工序中所使用的表面活性剂及在释放工序中所使用的脱糖链促进剂的混合液。虽然依糖链的分析方法而定有时可以将糖链以与上述表面活性剂等共存的混合液的状态用于分析，但是，例如在通过质量分析等进行分析时，优选在分析前对混合液进行糖链的纯化。
[0147]
纯化糖链时，例如，能够使用带有酰肼基的聚合物作为纯化用固相载体，使该纯化用固相载体与混合液接触。在混合液中，游离糖链形成环状半缩醛型与非环状醛型平衡状态，该醛基-cho与酰肼基-nh-nh2进行特异反应而形成稳定的-c＝n-nh-键。由此，能够将游离糖链捕集至纯化用固相载体。
[0148]
可以使被捕集到纯化用固相载体的糖链再次释放。作为再次释放的方法，可列举使固相载体和酸和有机溶剂的混合溶剂或酸和水和有机溶剂的混合溶剂接触而反应的方法。该混合溶剂的ph例如可以是2～9，也可以是2～7，也可以是2～6。在从弱酸性反应至接近中性时，能够抑制唾液酸残基的离去等糖链的水解，基于此点而优选。然而，也允许ph低的强酸条件。
[0149]
如后所述，能够用低分子化合物(标记化合物)修饰释放后的糖链。低分子化合物能够根据分析方法适当选择。另外，低分子化合物为可与构成固相载体的高分子化合物区分的化合物，优选为能够溶解于水或缓冲液、有机溶剂的化合物。
[0150]
[预处理工序]
[0151]
在本实施方式的方法中，还可以在释放工序之前具备预处理工序。由此，无需进行蛋白部分的分解处理便轻松地使糖链从糖蛋白释放。其结果，能够大幅缩短糖链释放处理所需要的时间。
[0152]
在预处理工序中，使含有被固定在固相的糖蛋白的试样与含表面活性剂的预处理剂接触。预处理工序可以在使含糖蛋白的试样与固相接触，结束糖蛋白的捕集之后，或者在结束固相合成之后或进而进行了清洗处理之后，且在与糖链释放酶接触之前进行。通过实施预处理工序，从而在释放工序中糖链释放酶更易作用于糖蛋白。
[0153]
预处理剂中所含有的表面活性剂可以是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂及非离子表面活性剂中的任一个。
[0154]
作为阴离子表面活性剂，并无特别限定，可列举皂等脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐、高级醇硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、α-磺基脂肪酸酯、α-烯烃磺酸盐、单烷基磷酸酯盐、烷基磺酸盐等，优选能够作为后述糖链释放工序中所使用的脱糖链促进剂来使用的阴离子表面活性剂(在本说明书中，将也能够用作脱糖链促进剂的阴离子表面活性剂特别称为酸衍生型阴离子表面活性剂。)。当在预处理工序中使用酸衍生型阴离子表面活性剂时，可以是与作为在糖链释放工序中所使用的脱糖链促进剂而列举的表面活性剂相同的表面活性剂，也可以是不同的表面活性剂。
[0155]
作为阳离子表面活性剂，并无特别限定，可列举烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、烷基二甲基苄基铵盐、胺盐类等。作为两性表面活性剂，并无特别限定，可列举烷基氨基脂肪酸盐、烷基甜菜碱、烷基氧化胺等。作为非离子表面活性剂，并无特别限定，可列举聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、烷基葡糖苷、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物等。
[0156]
可以以表面活性剂溶解在水或缓冲液中的状态使用预处理剂。当使用缓冲液时，作为缓冲剂，可列举碳酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、柠檬酸二铵、氨基甲酸铵等铵盐；三羟甲基铵等tris缓冲剂；磷酸盐等。优选，缓冲液的ph为5～10。若缓冲液的ph在该范围内，则轻松地确保在之后的工序中所使用的糖链释放酶的活性。在含糖蛋白的试样中，作为水或缓冲
液中所含有的除糖蛋白以外的成分，可列举金属盐等盐类、甘油等蛋白稳定剂等。
[0157]
预处理剂中的表面活性剂的浓度例如可以是0.01～30质量％，例如可以是0.2～1.0质量％，例如可以是0.2～0.3质量％，例如可以是0.22～0.27质量％。该浓度为上述下限值以上，且上述上限值以下，由此能够以良好的回收率得到在之后的糖链释放工序中释放的糖链。
[0158]
预处理剂在与固相接触之后，从固定在固相的糖蛋白分离。可以将所有的规定使用量的预处理剂放入容器内后一次性进行分离，也可以部分地将规定使用量的预处理剂分几次放入容器内并在每次放入容器内时进行分离。预处理剂的分离能够通过减压或离心分离等来进行。
[0159]
从快速制备的观点考虑，结束了预处理工序后的被固定在固相的糖蛋白无需进行清洗便能够用于后述释放工序。但是，也可以在预处理工序之后释放工序之前进行清洗操作。
[0160]
[标记工序]
[0161]
使用与进行了释放工序的容器相同的容器来进行标记工序。从而，在标记工序中，对进行了释放工序的容器中的游离生成物添加包含标记化合物的标记试剂(标记反应液)而得到含糖链的标记物的标记生成物。
[0162]
(标记化合物)
[0163]
标记化合物只要具有针对糖链的反应性基和应附加到糖链的修饰基，则并无特别限定。作为针对糖链的反应性基，可列举氧基氨基、酰肼基、氨基等。修饰基能够由本领域技术人员根据糖链的分析方法适当选择。
[0164]
例如，当标记化合物具有氧基氨基或酰肼基作为针对糖链的反应性基时，作为要附加到糖链的修饰基，例如能够选择选自精氨酸残基、色氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、半胱氨酸残基、赖氨酸残基中的氨基酸残基。
[0165]
当标记化合物包含精氨酸残基时，在测定修饰后的糖链的maldi-tof-ms时，会促进离子化而提高检测灵敏度，基于该点而优选。当标记化合物包含色氨酸残基时，因为该残基为荧光性且疎水性残基，所以在通过反相hplc检测修饰后的糖链时，会提高分离性，使荧光检测灵敏度提高，基于该点而优选。当标记化合物包含苯丙氨酸残基和/或酪氨酸残基时，适合通过修饰后的糖链的uv吸收进行检测，基于该点而优选。当标记化合物包含半胱氨酸残基时，能够将该残基的-sh基作为靶而利用icat试剂(美国abi公司)等标记试剂来加标记。当标记化合物包含赖氨酸残基时，能够将该残基的氨基作为靶而使用itraq试剂(美国applied biosystems,inc.)、exactag试剂(美国perkin inc.)等标记试剂而加标记。当标记化合物包含色氨酸残基时，能够将该残基的吲哚基作为靶而使用nbs试剂(日本、shimadzu corporation)来加标记。
[0166]
另外，例如，当标记化合物具有氨基作为针对糖链的反应性基时，作为应附加到糖链的修饰基，可列举芳香族基团。使用具有氨基和芳香族基的标记化合物时，通过还原氨基化来进行修饰。因为芳香族基团具有紫外可见吸收特性或荧光特性，所以在uv检测或荧光检测中的检测灵敏度得以提高，基于该点而优选。
[0167]
作为赋予这种芳香族基的标记化合物，具体而言，可列举8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐)、8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulphonate
(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸盐)、7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid(7-氨基-1,3-萘二磺酸)、2-amino-9(10h)-acridone(2-氨基-9(10h)-吖啶酮)、5-aminofluorescein(5-氨基荧光素)、dansylethylenediamine(丹磺酰乙二胺)、2-aminopyridine(2-氨基吡啶)、7-amino-4-methylcoumarine(7-氨基-4-甲基香豆素)、2-aminobenzamide(2-氨基苯甲酰胺)、2-aminobenzoic acid(2-氨基苯甲酸)、3-aminobenzoic acid(3-氨基苯甲酸)、7-amino-1-naphthol(7-氨基-1-萘酚)、3-(acetylamino)-6-aminoacridine(3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶)、2-amino-6-cyanoethylpyridine(2-氨基-6-氰基乙基吡啶)、ethyl p-aminobenzoate(对氨基苯甲酸乙酯)、p-aminobenzonitrile(对氨基苄腈)及7-aminonaphthalene-1,3-disulfonic acid(7-氨基萘-1,3-二磺酸)。
[0168]
其中，2-aminobenzamide(2-氨基苯甲酰胺)在反应规模大时也相对不易受到混杂物(例如，盐、蛋白及其他生物分子)的影响，有时基于该点而优选。另一方面，本实施方式的方法在反应规模小的情况下尤其有用。反应规模越小越不易受到混杂物的影响，因此能够应用于更多种的标记试剂(标记反应液)中。另外，只要能维持作为标记化合物的功能，则还优选使用上述化合物的衍生物。
[0169]
将标记化合物溶解于水、缓冲液和/或有机溶剂来使用。作为缓冲液，可列举与在前述释放工序中所使用的缓冲液相同的缓冲剂的水溶液。作为有机溶剂，可列举n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲基亚砜(dmso)及乙酸等极性有机溶剂及己烷等非极性溶剂。
[0170]
在通过还原氨基化进行修饰时，使糖链还原末端形成的醛基与标记化合物的氨基反应，在还原剂作用下形成的席夫碱还原，从而将修饰基导入到糖链的还原末端，由此能够有效地进行标记。
[0171]
作为还原剂，可列举氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、甲胺硼烷、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷、甲基吡啶硼烷、吡啶硼烷等。
[0172]
其中，从安全性及反应性这两个方面考虑，优选使用甲基吡啶硼烷(2-甲基吡啶-硼烷)。从相同的观点考虑，用甲基吡啶硼烷作为还原剂时，作为标记化合物，例如优选使用2-氨基苯甲酰胺。
[0173]
(标记工序的操作及反应条件)
[0174]
在标记工序中，对游离生成物添加标记试剂(标记反应液)。当使用还原氨基化进行修饰时，标记试剂可以包含具有氨基及芳香族基的标记化合物、还原剂及溶剂。在标记工序中，可以继续使用已进行释放工序的容器，但在添加标记试剂时，不要对游离生成物进行清洗等会使其相对组成(除溶剂以外的成分比)发生变化的处理。另外，可允许对游离生成物添加水、缓冲液和/或有机溶剂而进行溶解或稀释。
[0175]
标记化反应体系是在如下状态下构建的，即将水、缓冲液和/或有机溶剂作为溶剂，且在该溶剂中混合有包含糖链及标记化合物的标记反应液和固定在固相的蛋白、其他释放工序的残留物。
[0176]
作为缓冲液，可列举与在前述释放工序中所使用的缓冲液相同的缓冲剂的水溶液。作为有机溶剂，可列举二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)等非质子性极性有机溶剂、有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等)及醇(甲醇、乙醇、丙醇等)等质子性极性有机溶剂及己烷等非质子性非极性溶剂。这些溶剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
[0177]
在标记化反应液中，例如可以以载体的使用体积的0.1～10倍体积使用标记试剂(标记反应液)，例如可以以0.5～5倍体积使用。并且，标记试剂中的标记化合物的浓度例如可以是1～20m，例如也可以是2～15m。从以定量进行标记的方面考虑，优选标记化合物的量为上述下限值以上，且从轻松地去除过量试剂的方面考虑，优选为上述上限值以下。
[0178]
标记反应液中的还原剂的浓度例如可以是0.5～10m，例如可以是1～7.5m。从轻松地以定量进行标记的方面考虑，优选还原剂的量为上述下限值以上，且从轻松地去除过量试剂的方面考虑，优选为上述上限值以下。
[0179]
关于溶剂的量，可以以载体的使用体积的0.5～10倍体积使用，例如可以以1～5倍体积使用。从溶解性的观点考虑，优选溶剂的量为上述下限值以上，且从以定量进行标记的方面考虑，优选为上述上限值以下。
[0180]
标记反应液的反应温度例如可以是4～80℃，例如也可以是25～70℃。从反应时间变短的方面考虑，优选反应温度为上述下限值以上，且从抑制因高温引起糖链局部分解的方面考虑，优选为上述上限值以下。标记反应液的反应时间例如可以是5～600分钟，例如也可以是30～300分钟。从定量标记的方面考虑，优选反应时间为上述下限值以上，且从抑制糖链局部分解的方面考虑，优选为上述上限值以下。
[0181]
标记化反应在常温下快速进行，因此从添加了标记试剂(标记反应液)时起标记化合物就发挥作用而生成糖链标记物。从而，在添加标记试剂之后，与该反应是否结束无关而能够在任意时刻进行后述分离工序。或者，可以在释放工序后进行在后面叙述的分离工序而得到分离液，然后对分离液添加标记试剂。
[0182]
以下，使用甲基吡啶硼烷作为还原剂的情况进行说明。在使用甲基吡啶硼烷作为还原剂的情况下，优选溶剂包含质子性溶剂。由此，因为能够以高浓度溶解标记化合物(优选2-氨基苯甲酰胺。以下在使用甲基吡啶硼烷的情况下均相同。)及甲基吡啶硼烷，所以标记工序中所需要的时间得以缩短。
[0183]
即，标记试剂(标记反应液)可以包含2-氨基苯甲酰胺、甲基吡啶硼烷及溶剂。通过使用毒性低的甲基吡啶硼烷，能够进行安全性高的标记。
[0184]
从更优选得到缩短标记工序中所需要的时间的效果的观点考虑，优选质子性溶剂为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等有机酸。并且，优选有机酸在标记反应体系中为液体。其中，从操作容易性的观点考虑，优选有机酸为乙酸。
[0185]
溶剂中的质子性溶剂的浓度例如可以是40～100体积％。由此，可得到良好的标记效率。从得到更良好的标记效率的观点考虑，溶剂中的质子性溶剂的浓度可以是50～100体积％，也可以是75～100体积％。
[0186]
当上述质子性溶剂的沸点相对较低时(例如沸点低于140℃时)，可以在质子性溶剂的基础上，同时使用沸点比该质子性溶剂高的溶剂。由此，能够延迟标记工序中的上述沸点相对低的质子性溶剂的挥发速度。其结果，能够在标记工序中抑制不想要的未反应物的析出。由此，能够以良好的收率得到标记糖链。在糖链的规模小的情况、溶剂量少的情况和/或反应时间变长的情况下，能够选择同时使用这种沸点高的溶剂(以下，记载为高沸点溶剂。)的方式。
[0187]
作为上述高沸点溶剂，例如可以是沸点140～200℃的非质子性溶剂。作为具体的高沸点溶剂，可列举二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮等。
[0188]
当同时使用高沸点溶剂时，从提高作为所述标记化合物的2-氨基苯甲酰胺及所述还原剂的溶解性、反应性的观点考虑，优选其量的体积％比质子性溶剂低，可以是质子性溶剂的4体积％以上且小于100体积％，也可以是4～70体积％。高沸点溶剂的量在上述下限值以上，可轻松地延迟质子性溶剂的挥发速度，基于此点而优选；在上述上限值以下，可轻松地得到质子性溶剂的效果(提高作为所述标记化合物的2-氨基苯甲酰胺及所述还原剂的溶解性、反应性的效果)，基于此点而优选。
[0189]
当使用甲基吡啶硼烷作为还原剂时，最优选使用乙酸与二甲基亚砜的混合溶剂作为溶剂。
[0190]
当使用甲基吡啶硼烷作为还原剂时，标记试剂(标记反应液)中的标记化合物的浓度可以是1～20m，也可以是2～15m。基于缩短标记工序的时间而优选标记化合物的浓度在上述下限值以上；基于轻松地去除过量试剂而优选在上述上限值以下。
[0191]
标记反应液中的甲基吡啶硼烷的量，例如可以是0.5～10m，例如也可以是1～7.5m。基于缩短标记工序的时间而优选甲基吡啶硼烷的量为上述下限值；基于轻松地去除过量试剂而优选为上述上限值以下。
[0192]
当使用甲基吡啶硼烷作为还原剂时，溶剂的量可以是载体的使用体积的0.1～10倍体积，也可以是0.5～5倍体积。基于溶解性而优选溶剂的量为上述下限值以上；基于缩短标记工序的时间而优选为上述上限值以下。
[0193]
标记反应液的反应温度，例如可以是4～80℃，例如也可以是25～70℃。基于缩短反应时间而优选反应温度为上述下限值以上；基于抑制因高温引起糖链局部分解而优选为上述上限值以下。标记反应液的反应时间，例如可以是2～120分钟，例如也可以是5～40分钟。基于定量标记而优选反应时间为上述下限值以上；基于抑制糖链的局部分解而优选为上述上限值以下。
[0194]
(标记生成物)
[0195]
在标记工序后的容器内存在糖链的标记物及结合于固相的蛋白。因此，通过标记工序得到的标记生成物可包含糖链的标记物及结合于固相的蛋白。结合于固相的蛋白中，构成糖蛋白的蛋白部分中的氨基酸残基之间的肽键仍未被切断。标记生成物可以被含在水、缓冲液和/或有机溶剂中。
[0196]
[分离工序]
[0197]
(糖链标记物的溶出)
[0198]
在标记工序之后，可以进行通过固液分离而从标记生成物得到包含糖链的标记物的分离液的分离工序。由此，能够轻松地分离糖链的标记物。例如，通过将洗提液通入标记生成物，能够溶出糖链的标记物。在该情况下所使用的洗提液可以是水、水溶液、胶体溶液等水类溶液。作为洗提液，可以选择具备对固相与蛋白部分之间的结合有切断能力的性质的物质(例如通过色谱法来进行标记糖链的分析的情况等)，也可以选择不具备这种性质的物质(例如通过质量分析来进行标记糖链的分析的情况等)。由此，可得到包含糖链的标记物的分离液。
[0199]
分离液中存在糖链的标记物，同时还存如下的废物，即在标记工序中用过的剩余的标记化合物、以及在释放工序中使用了脱糖链促进剂的情况下的酸衍生型阴离子表面活性剂等。在选择了对固相与蛋白部分的结合有切断能力物质作为洗提液的情况下，分离液
中还会混入蛋白。在选择了对针对固相与蛋白部分的结合不具有切断能力的物质作为洗提液的情况下，在分离液中实质上不含蛋白。
[0200]
(纯化)
[0201]
依糖链的分析方法而定也可以从分离液去除废物而对标记糖链进行纯化。可以通过将分离液通入纯化用固相来捕集糖链的标记物，再对捕集到的糖链的标记物进行再溶出，由此进行废物的去除。
[0202]
作为纯化用固相的一个示例，可列举利用非共价结合来捕集标记糖链的固相。具体而言，能够使用硅胶柱、氨基柱、其他正相固相。
[0203]
作为纯化用固相的另一个示例，可列举利用共价结合来捕集标记糖链的固相。由此，在混合有蛋白的情况等中，能够提高标记糖链的纯化度。具体而言，能够将具有酰肼基的聚合物用作纯化用固相载体。在分离液中，游离糖链形成环状半缩醛型和非环状醛型的平衡状态，因此该醛基-cho与酰肼基-nh-nh2进行特异反应而形成稳定的键-c＝n-nh-。由此，能够将游离糖链捕集至纯化用固相载体。在再释放中，能够使酸和有机溶剂的混合溶剂或酸和水和有机溶剂的混合溶剂与固相载体接触而反应。该混合溶剂的ph，例如可以是2～9，也可以是2～7，也可以是2～6。从弱酸性反应至接近中性时，能够抑制唾液酸残基的离去等糖链的水解，基于此点而优选。然而，也允许ph低的强酸条件。
[0204]
[分析工序]
[0205]
通过本实施方式的方法制备的糖链的标记物，能够通过质量分析法(例如，maldi-tof ms)、色谱法(例如，高速液体色谱法或hpae-pad色谱法)、电泳(例如，毛细管电泳)等公知的方法进行定性和/或定量分析。在糖链的分析中，能够利用各种数据库(例如，glycomod、glycosuite、simglycan(注册商标)等)。
[0206]
通过上述这样的糖蛋白的糖链分析，例如，能够快速进行如下分析，即在抗体药物的研发、制造及质量保证等过程中开展的抗体药物的糖链修饰分析、在糖链生物标志物的检索研究等过程中开展的血清等检测体中的糖蛋白的分析、干细胞的糖链分析、电泳凝胶带中的糖链分析、植物组织的糖链分析等。
[0207]
[试剂盒]
[0208]
在一实施方式中，本发明提供一种制备糖蛋白的糖链的试剂盒，该试剂盒具备用于固定糖蛋白的固相、用于承载所述固相来进行糖链的释放和标记的容器、及糖链释放酶。
[0209]
本实施方式的试剂盒用于实施上述制备糖蛋白的糖链的方法。本实施方式的试剂盒可以包括用于试剂盒使用的协议信息。用于试剂盒使用的协议信息可以是提示上述本发明的制备糖蛋白的糖链的方法的印刷物，也可以是能够获取提示该方法的网页信息的访问信息。
[0210]
并且，本实施方式的试剂盒还可以具备含表面活性剂的预处理剂、含酸衍生型阴离子表面活性剂的脱糖链促进剂、标记试剂、净化用固相、用于填充净化用固相的容器中的任一个或全部。
[0211]
在此，预处理剂中所含有的表面活性剂和脱糖链促进剂中所含有的酸衍生型阴离子表面活性剂可以是相同的化合物。在该情况下，可以不区分预处理剂和脱糖链促进剂而将它们收纳于一个容器中。
[0212]
用于承载对糖蛋白进行固定的固相并进行糖链的释放和标记的容器或用于填充
净化用固相的容器，可以是管柱、多孔板、过滤板、微型管等，优选为旋转柱。旋转柱还可以具备收集管，该收集管回收通过离心分离而被固液分离的分离液。容器可以在填充有固相的状态下包含于试剂盒，也可以作为与固相不同的项目包含于试剂盒。
[0213]
用于固定糖蛋白的固相是在表面具有能与糖蛋白结合的特异结合性的非共价结合性基团(氢键性基团及离子键性基团)及共价结合性基团等结合性官能团的固相。作为固相，例如可列举阳离子交换载体、疏水性相互作用载体、无机载体等，不包括仅承载糖蛋白的固相，例如电泳凝胶或转印用膜片等。
[0214]
固相可以是无机载体。载体为无机载体时，例如载体的一部分不会在糖链释放酶的作用下释放。因此，在被释放的糖链的分析中，易于抑制多余的信号的出现。
[0215]
当糖蛋白为抗体时，固相的表面可以具有选自蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白h、蛋白d、蛋白arp中的配体。由此，能够对糖链解析的重要性特别高的抗体进行高生产率的糖链试样制备及解析。
[0216]
另外，标记试剂可以包含2-氨基苯甲酰胺、还原剂及溶剂。并且，2-氨基苯甲酰胺、还原剂及溶剂可以分别收纳在不同的容器内，而在使用时再进行混合。
[0217]
根据本实施方式的试剂盒，无需进行蛋白部分的分解处理便能够使糖链从糖蛋白释放。从而，能够大幅缩短糖链释放处理所需要的时间。并且，能够使糖链释放酶易于在糖链释放处理中发挥作用。
[0218]
另外，当试剂盒包含标记试剂时，在不对游离生成物进行分离的状态下直接添加标记试剂，因此能够由糖蛋白非常快速地制备分析用试样(标记过的方式)状态的糖链。
[0219]
[装置]
[0220]
在一实施方式中，本发明提供一种制备糖蛋白的糖链的装置，该装置具备支撑收纳了试样的容器的容器支撑部、和向所述容器导入试剂的试剂导入部，所述试样含有被固定在固相的糖蛋白，所述试剂导入部包括向所述容器导入糖链释放酶的糖链释放酶导入部、和向所述容器导入标记试剂的标记试剂导入部。另外，下面即将说明的装置的结构仅为一个示例，而本发明的权利范围并不局限于该结构。
[0221]
图24为对本实施方式的装置进行说明的示意图。装置100具备支撑收纳了试样的容器15的容器支撑部20和向所述容器15导入试剂的试剂导入部30，所述试样含有被固定在固相10的糖蛋白，所述试剂导入部30包括向所述容器15导入糖链释放酶31的糖链释放酶导入部35和向所述容器导入标记试剂32的标记试剂导入部35。在本例中，糖链释放酶导入部及标记试剂导入部由相同的部件构成。
[0222]
容器支撑部20用于支撑反应容器15，所述反应容器15要收纳含有被固定在固相10的糖蛋白的试样。容器支撑部20支撑容器15的方式并无特别限定，例如可列举使容器的大部分嵌入容器支撑部20的支撑穴或支撑孔而支撑的方式。除此以外，可列举使容器的卡合凹部(卡合凸部)卡合于容器支撑部的卡合凸部(卡合凹部)而支撑的方式、通过容器支撑部的夹持部来夹持而支撑容器的方式。
[0223]
试剂导入部30用于向被容器支撑部20支撑的容器15内导入液体类。试剂导入部30至少包括导入在释放工序中所使用的糖链释放酶31的糖链释放酶导入部35和导入在标记工序中所使用的标记试剂32的标记试剂导入部35。
[0224]
在图24的例中，试剂导入部30具备收纳糖链释放酶31、标记试剂32、预处理剂/脱
糖链促进剂33的罐34、对罐34所收纳的各试剂进行输送的输送管35a、对各试剂的输送进行控制的阀(36、37、38)、和向容器15的内部导入各试剂的导入部35。
[0225]
糖链释放酶导入部35及标记试剂导入部35向同一个反应容器15内添加糖链释放酶31和标记试剂32。通过试剂导入部30向反应容器15内导入液体的方式并无特别限定，例如可列举从储藏有要输送的液体的输送源(31、32、33)经由管状部件向反应容器15内输送的方式。除此以外，还可列举将收集在管状部件中的液体注入反应容器内的方式等。
[0226]
糖链释放酶导入部35和标记试剂导入部35可以作为分别独立的构成部件而构成。该情况下，糖链释放酶31和标记试剂32可以依次逐一被导入，也可以在相同的时刻被导入。可以自动控制标记试剂导入部35，当逐一导入两种试剂时，可以根据在释放工序中所需要的反应时间等来控制标记试剂导入部35的工作时刻。
[0227]
或者，糖链释放酶导入部35与标记试剂导入部35也可以作为相同的构成部件而构成。该情况下，糖链释放酶31和标记试剂32可以在被混合的状态下导入，也可以依次分别逐一被导入。当逐一导入两种试剂时，可以根据在释放工序中所需要的反应时间等来控制输送标记试剂的时刻、即使液体导入部作为标记试剂导入部发挥功能的时刻。
[0228]
装置100还可以具备对容器15的收纳物进行固液分离的固液分离部40。当装置100包括固液分离部40时，固液分离部40将容器15中所含有的收纳物分离成固体和液体。固体为残留在容器15中的物质，实质上为固相10及固定在该固相的物质。该情况下，使用具有能够进行固液分离的过滤器的器具(例如旋转柱、带过滤器的微孔板等)作为容器15。而且，可以在容器15中安装回收容器16(例如收集管、收集板等)。进一步在该情况下，容器支撑部20的构成中也可包括支撑安装在容器15的回收容器16的回收容器支撑部。在图24的例中，回收容器支撑部与容器支撑部20由相同的部件材料构成。
[0229]
作为固液分离部40的具体分离方式并无特别限定，可以是离心过滤、减压过滤、加压过滤中的任一种。图24的例中，固液分离部40的分离方式为离心过滤。固液分离部40具备支撑容器15(或容器16)的支架41、驱动轴42及马达43。
[0230]
如图24的例，固液分离部40可以作为从进行释放工序及标记工序的容器支撑部20独立出来构成部件而构成。该情况下，装置100可以包括从容器支撑部20向固液分离部40自动输送容器15(及容器16)的容器输送部50。容器输送部50的构成可以是在容器15(及容器16)的输送中仅输送容器15，其构成也可以是在安装了回收容器16的状态下输送容器15。容器输送部50的构成中可以包括机械臂和控制该机械臂工作的机械臂控制部，所述机械臂以直接或间接地(即经由回收容器16)抓住和放开容器15并移动的方式工作。
[0231]
通过使固液分离部40工作，从而液体得以被回收到回收容器16。因此，例如能够利用减压过滤、加压过滤、离心分离等方式，从通过导入糖链释放酶31和标记试剂32而得到的反应容器中的反应物(即反应后的反应容器的收纳物)将含糖链的标记物的分离液回收到回收容器16中。并且，例如在对含有被固定在固相10的糖蛋白的试样进行制备的工序中，能够通过使含糖蛋白的试样与固相接触进行捕集来得到的制备物，并从该制备物中将被固定在固相10的糖蛋白残留于容器15内而同时将液体成分废弃到回收容器16内。
[0232]
另外，当装置100具有固液分离部40时，也可以以能够进一步向容器15内导入清洗液的方式来构成上述液体导入部35。由此，能够将清洗液通入容器15。
[0233]
装置100还可以具备温度调节部60，该温度调节部60对容器15的收纳物的温度进
行调节。当装置100包括温度调节部60时，温度调节部60至少具有加热器功能即可。温度调节部60将容器15加热至释放工序及标记工序中各自所需要的温度。而且，也可以以确保有开放空间来与反应容器内部的空间连通的方式构成装置100。由此，在利用开放体系进行释放工序时容器15内的溶剂会蒸发，因此无论糖蛋白的量如何都可轻松地提供有效地进行糖链释放的浓度。而且，随着释放反应一并进行溶剂去除，因此省去了用于与释放工序分开进行溶剂去除工序的时间，从而能够更快速地制备糖链。
[0234]
装置100可以包括液体输送部50，该液体输送部50将通过标记工序后的固液分离而回收到回收容器内的含糖链的标记物的分离液自动输送到收纳有纯化用固相的纯化用管柱中。使用时，可以将纯化用管柱设置于上述固液分离部40。
[0235]
装置100中，可工作的构成部分(例如，液体导入部35、机械臂50、固液分离部40、温度调节部60、液体输送部50)中的至少任一个可以被自动控制，优选全部均可以被自动控制。由此，能够更加快速地进行糖蛋白的糖链的制备。
[0236]
实施例
[0237]
以下，列举实施例对本发明进行进一步详细的说明。然而，本发明并不限定于以下实施例。
[0238]
[比较例1]
[0239]
(通过胰蛋白酶消化进行糖链释放及游离糖链纯化之后的糖链标记)
[0240]
向水中包含1mg/ml的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)的抗体液10μl添加1m的碳酸氢铵水溶液1μl和120mm的二硫苏糖醇水溶液1μl，在60℃下静置了30分钟。接着，添加120mm的碘乙酰胺水溶液2μl，在室温(25℃)、遮光下静置了60分钟。接着，添加3mg/ml的胰蛋白酶溶液(sigma-aldrich,co.llc.制)4μl，在37℃下进行了16小时的胰蛋白酶消化。接着，在100℃下进行5分钟的处理而使胰蛋白酶失活。
[0241]
接着添加0.5mu/ml的pngase f液(takara bio inc.)2.5μl，在50℃下进行10分钟的糖链释放反应而使糖链释放。对反应后的混合液，使用糖链纯化试剂盒blotglyco(注册商标)珠子(sumitomo bakelite co.,ltd.制造)捕集游离糖链，然后通过再释放(游离糖链的纯化)及2-氨基苯甲酰胺(以下，有时称为“2ab”。)进行标记，从而得到了含有粗制2ab标记糖链的分离液。
[0242]
接着，在所得到的含有粗制2ab标记糖链的分离液中添加乙腈而应用于净化管柱，从而进行清洗来去除剩余的标记试剂，之后，用纯水溶出而得到了含有已纯化的2ab标记糖链的分离液。从胰蛋白酶消化得到已纯化的2ab标记糖链所花的时间约为30小时。
[0243]
接着，通过hplc检测2ab标记糖链。将所得到的hplc图谱示于图1。如图1所示，作为2ab标记糖链的峰，检测出了用图中1～6的序号表示的峰及用箭头表示的峰。用箭头表示的峰源自唾液酸糖链。以下，用图1中的序号1～6代表2ab糖链的各个峰。并且，在下述表1中给出了在峰序号1至6的峰面积之和设为100的情况下的各峰的面积比率。还对序号6的面积比率相加了如下面积比率，即在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的峰值中的、比序号6的峰值稍微延迟而溶出来与序号6的峰值重叠而检测出的峰值的面积比率。
[0244]
[表1]
[0245]
峰序号面积比率(％)122.58
26.76338.52417.4952.30611.14
[0246]
[实施例1]
[0247]
(在protein a-sepharose(琼脂糖蛋白a)上的糖链释放及糖链标记)
[0248]
将20μg的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)溶解于磷酸缓冲液(pbs)而成的液体用于25μl的琼脂糖蛋白a(ge healthcare制)，并用pbs进行了清洗。
[0249]
接着，添加9μl的0.5mu/ml pngase f溶液(takara bio inc.制)及1μl的1m的碳酸氢铵水溶液，在50℃下进行15分钟的糖链释放反应而使糖链释放。
[0250]
然后，添加50μl的2ab溶液(将50mg的2-氨基苯甲酰胺、60mg的sodium cyanoborohydride(氰基硼氢化钠)、300μl的乙酸及700μl的dimethyl sulfoxide(二甲基亚砜)进行混合而成的溶液)，在60℃下进行了2小时的反应。
[0251]
接着，用台式离心机进行离心，得到了含有粗制2ab标记糖链的分离液。向所得到的含有粗制2ab标记糖链的分离液添加乙腈而应用于单片二氧化硅旋转柱，进行清洗之后，用50μl的纯水进行溶出而得到了含有已纯化的2ab标记糖链的分离液。
[0252]
接着，在下述表2所示的条件下，对所得到的含有已纯化的2ab标记糖链的分离液1μl进行了hplc测定。
[0253]
[表2]
[0254][0255]
表2的a液及b液分别为构成流动相的液体，将这些a液和b液进行混合来调整流动相的极性。并且，在表2中，“b：a％(t1分钟)
→
b：b％(t2分钟)”的记载表示在(t2―t1)分钟内将b溶液的浓度从a％改变至b％。其中，t1、t2、a、b分别表示实数。并且，在表2中，％表示体积％。
[0256]
将所得到的hplc图谱示于图2。如图2所示，确认到检测出2ab标记糖链。另外，整个工序(从抗体吸附于琼脂糖蛋白a至hplc检测)所花的时间约为3小时。
[0257]
[实施例2]
[0258]
(在protein a(蛋白a)结合单片二氧化硅上的糖链释放及糖链标记)
[0259]
将固相变更为结合了蛋白a的单片二氧化硅(使用体积约为25μl)，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0260]
将所得到的hplc图谱示于图3。如图3所示，确认到检测出2ab标记糖链。另外，在本实施例中几乎未检测出在实施例1中在停留时间比2ab标记糖链短的范围内检测到的干扰，并且在2ab标记糖链的检出范围内干扰也得以减少。另外，整个工序(从抗体吸附于蛋白a-单片二氧化硅至hplc检测)所花的时间约为3小时。
[0261]
[实施例3]
[0262]
(在预处理过的蛋白a结合单片二氧化硅上的使用了脱糖链促进剂的糖链释放及糖链标记)
[0263]
将固相变更为结合了蛋白a的单片二氧化硅(使用体积约为5μl)，使pngase f发挥作用之前通入500μl的0.4质量％n-月桂酰基肌氨酸钠(以下，有时称为“nls”。)水溶液，以及将在糖链释放时使用的9μl的pngase f溶液和1μl的1m的碳酸氢铵水溶液分别变更为2μl的pngase f溶液和含有nls的2μl的0.2m的碳酸氢铵水溶液(与pngase f溶液混合之后的nls的最终浓度为0.2质量％)，除此以上点以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0264]
将所得到的hplc图谱示于图4。如图4所示，确认到检测出2ab标记糖链。而且，在本实施例中，还检测到相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链。
[0265]
另外，在下述表3给出了将峰序号1至峰序号6的峰面积之和设为100的情况下的各峰的面积比率。还对序号6的面积比率相加了如下面积比率，即相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链的峰值中的、比序号6的峰值稍微延迟而溶出来与序号6的峰值重叠而检测出的峰值的面积比率。
[0266]
[表3]
[0267]
峰序号面积比率(％)123.0226.52340.24417.0852.32610.23
[0268]
在本实施例中，虽然整个工序(从抗体吸附于蛋白a-单片二氧化硅至hplc检测)所花的时间仅为3小时，但实现了毫不逊色于在后面叙述的参考例1的良好的回收率。另外，对相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链的峰，检测出了与通过进行胰蛋白酶消化来进行了糖链释放的比较例1相同的令人满意的强度。
[0269]
[参考例1]
[0270]
(在蛋白a结合单片二氧化硅上的使用了脱糖链促进剂的糖链释放及糖链纯化后的糖链标记)
[0271]
将固相变更为结合了蛋白a的单片二氧化硅(使用体积约为5μl)，将在糖链释放时使用的9μl的pngase f溶液和1μl的1m的碳酸氢铵水溶液分别变更为2μl的pngase f溶液和含有nls的2μl的0.2m的碳酸氢铵水溶液(与pngase f溶液混合之后的nls的最终浓度为0.2质量％)，除此以外，直至糖链释放为止进行了与实施例1相同的操作。
[0272]
接着，用台式离心机进行离心而得到包含粗游离糖链的分离液，并使该分离液与糖链纯化试剂盒blotglyco(注册商标)珠子(sumitomo bakelite co.,ltd.制造)接触来捕
集游离糖链，进而进行所捕集到的糖链的再释放(游离糖链的纯化)及基于2-氨基苯甲酰胺(2ab)的标记，得到了含有粗制2ab标记糖链的分离液。向所得到的含有粗制2ab标记糖链的分离液中添加乙腈而应用于单片二氧化硅旋转柱，进行清洗而去除剩余的标记试剂之后，用50μl的纯水进行溶出，得到了含有已纯化的2ab标记糖链的分离液。
[0273]
将所得到的hplc图谱示于图5。如图5所示，确认到检测出2ab标记糖链。而且，在本参考例中还检测到相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链。
[0274]
另外，在下述表4中给出了将峰序号1至峰序号6的峰面积之和设为100的情况下的各峰的面积比率。在导出序号6的面积比率时还相加了如下面积比率，即相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链的峰值中的、比序号6的峰值稍微延迟而溶出来与序号6的峰值重叠而检测出的峰值的面积比率。
[0275]
[表4]
[0276]
峰序号面积比率(％)126.9626.42338.32415.8652.9169.54
[0277]
如表4所示，实现了良好的回收率。但是，在本参考例中，整个工序(从抗体吸附于蛋白a-单片二氧化硅至hplc检测)花费了7小时。
[0278]
[实施例4]
[0279]
(基于粗制抗体的在预处理蛋白a结合单片二氧化硅上的使用了脱糖链促进剂的糖链释放及糖链标记)
[0280]
使用了将20μg的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)溶解于细胞培養液而成的粗制抗体液来替代将20μg的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)溶解于pbs而成的液体，除此以外，进行了与实施例3相同的操作。
[0281]
将所得到的hplc图谱示于图6。如图6所示，确认到检测出2ab标记糖链。而且，在本实施例中，也检测到相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链。
[0282]
在本实施例中，尽管使用了未被纯化的抗体，但整个工序(从抗体吸附于蛋白a-单片二氧化硅至hplc检测)中仅需要3小时，检测到与实施例2、实施例3及参考例1同样好的图谱。另外，对相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链的峰，检测出了与通过进行胰蛋白酶消化来进行了糖链释放的比较例1相同的令人满意的强度。
[0283]
并且，在下述表5中给出了将峰序号1至峰序号6的峰面积之和设为100的情况下的各峰的面积比率。还对序号6的面积比率相加了如下面积比率，即相当于在图1中标注了箭头的唾液酸糖链的唾液酸糖链的峰值中的、比序号6的峰值稍微延迟而溶出来与序号6的峰值重叠而检测出的峰值的面积比率。
[0284]
[表5]
[0285]
峰序号面积比率(％)122.74
26.77339.35416.8552.35611.55
[0286]
[再现性的验证]
[0287]
进行3次实施例4，推导出了序号1至序号7的峰面积及面积比率的变异系数cv(100
×
(标准偏差/平均值))。将其结果示于表6。表6表明实施例的制备方法的再现性良好。即，表明实施例的制备方法的可靠性高。
[0288]
[表6]
[0289]
峰序号cv(％)＝100
×
(标准偏差/平均值)10.4622.3330.1040.3150.8060.15
[0290]
[峰图形的验证]
[0291]
图7所示的柱状图比较了比较例1(整个工序30小时)、参考例1(整个工序7小时)、实施例3(3小时)的序号1至序号6的峰面积比。在图7中，横轴表示峰序号，纵轴表示峰面积比率。图7示表明从比较例1来看实施例3不仅实现了惊人的时间缩短而且维持了良好的峰图形。
[0292]
[实施例5]
[0293]
将2ab溶液设为由48mg的氰基硼氢化钠、80mg的2-氨基苯甲酰胺、240μl的乙酸及560μl的二甲基亚砜混合而成的溶液，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。将所得到的hplc图谱示于图8。
[0294]
[实施例6]
[0295]
将2ab溶液设为由48mg的氰基硼氢化钠、80mg的2-氨基苯甲酰胺、120μl的乙酸及40μl的二甲基亚砜混合而成的溶液，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。将所得到的hplc图谱示于图9。
[0296]
[实施例7]
[0297]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、120μl的乙酸及40μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度75体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。将所得到的hplc图谱示于图10。
[0298]
[峰面积值总和的验证(与还原剂及浓度的关系)]
[0299]
图11所示的柱状图比较了实施例5(反应时间2小时、低浓度nabh3cn)、实施例6(反应时间40分钟、高浓度nabh3cn)及实施例7(反应时间40分钟、高浓度甲基吡啶硼烷)的hplc图谱中的序号1至序号6(参考图1)的峰面积值的总和。在图11中，纵轴表示峰面积值的总
和。而且，在各自的柱状图上还给出了将实施例7的峰面积值总和设为100％的情况下的相对峰面积值总和的比率。图11表明，通过将还原剂nabh3cn设为高浓度从而观察到了反应速度的提升。而且，还表明，与使用nabh3cn作为还原剂的情况相比，使用甲基吡啶硼烷作为还原剂的情况下的反应速度的提升效果极其显著。
[0300]
[实施例8]
[0301]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、64μl的乙酸及96μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度40体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0302]
[实施例9]
[0303]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、80μl的乙酸及80μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度50体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0304]
[实施例10]
[0305]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、96μl的乙酸及64μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度60体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0306]
[实施例11]
[0307]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、112μl的乙酸及48μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度70体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0308]
[实施例12]
[0309]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、128μl的乙酸及32μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度80体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0310]
[实施例13]
[0311]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、144μl的乙酸及16μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度90体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0312]
[实施例14]
[0313]
将2ab溶液设为由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、152μl的乙酸及8μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度95体积％)，并且将2ab标记中所需要的反应时间设为40分钟，除此以外，进行了与实施例1相同的操作。
[0314]
[峰面积值总和的验证(与乙酸浓度的关系)]
[0315]
将在实施例8(乙酸浓度40体积％)～实施例14(乙酸浓度95体积％)中得到的hplc图谱与实施例7(乙酸浓度75体积％)的hplc图谱一同示于图12及图13。而且，在图14所示的柱状图中比较了实施例7～14的hplc图谱中的序号1至序号6(参考图1)的峰面积值的总和。在图14中，纵轴表示峰面积值的总和，横轴表示乙酸浓度。而且，在各自的柱状图上还示出将实施例7的峰面积值总和设为100％的情况下的相对峰面积值总和的比率。
[0316]
如图14所示，在乙酸浓度为40体积％时，其峰面积值的总和的比率是乙酸浓度为
75体积％时的44.7％，一并参考图11，表明了反应速度的提升效果较高。乙酸浓度为60体积％以上时，表明稳定地得到了进一步被提升的反应速度(确保具有乙酸浓度为75体积％时的70％以上的峰面积值)。尤其，乙酸浓度为75体积％以上时，表示稳定地得到了极大地被提升的反应速度(确保了具有乙酸浓度为75体积％时的约90％以上的峰面积值)。
[0317]
[实施例15]
[0318]
使用与实施例7相同的2ab溶液(由40mg的2-甲基吡啶硼烷、80mg的2-氨基苯甲酰胺、120μl的乙酸及40μl的二甲基亚砜混合而成的溶液(乙酸浓度75体积％))，对将2ab标记中所需要的反应时间设为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟及40分钟的各个情况下得到了hplc图谱。将所得到的hplc图谱示于图15。
[0319]
[峰面积值总和的验证(与反应时间的关系)]
[0320]
图16所示的柱状图比较了实施例15中所得到的hplc图谱中的序号1至序号6(参考图1)的峰面积值的总和。在图16中，纵轴表示峰面积值的总和，横轴表示反应时间。而且，在各个柱状图上给出了将反应时间为40分钟时的峰面积值总和设为100％的情况下的相对峰面积值总和的比率。
[0321]
如图16所示，当反应时间为5分钟时，峰面积值的总和的比率是反应时间为40分钟时的46.6％，一并参考图11，表明了反应速度的提升效果较高。反应时间为10分钟以上时，表明稳定地得到了进一步被提升的反应速度(确保了具有反应时间为40分钟时的约80％以上的峰面积值)。尤其，反应时间为25分钟以上时，表明稳定地得到了极大地被提升的反应速度(确保了具有反应时间为40分钟时的95％以上的峰面积值)。
[0322]
[比较例2]
[0323]
(基于胰蛋白酶消化的糖链释放)
[0324]
对在水中包含1mg/ml的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)的抗体液10μl添加1m的碳酸氢铵水溶液1μl和120mm的二硫苏糖醇水溶液1μl，在60℃下静置了30分钟。接着，添加120mm的碘乙酰胺水溶液2μl，在室温(25℃)、遮光下静置了60分钟。接着，添加3mg/ml的胰蛋白酶溶液(sigma-aldrich,co.llc.制)4μl，在37℃下进行了16小时的胰蛋白酶消化。接着，在100℃下进行5分钟的处理而使胰蛋白酶失活。
[0325]
接着添加0.5mu/ml的pngase f液(takara bio inc.)2.5μl，在50℃下进行10分钟的糖链释放反应，使糖链释放。对反应后的混合液，使用糖链纯化试剂盒blotglyco(注册商标)珠子(sumitomo bakelite co.,ltd.制造)捕集游离糖链，然后通过再释放及2-氨基苯甲酰胺(2ab)进行了荧光标记。从胰蛋白酶消化至得到所标记的游离糖链所花的时间约为30小时。
[0326]
利用hplc检测了修饰后的游离糖链。将所得到的hplc图谱示于图17。在图17中给出了各峰的辨认结果。如图17所示，检测到各种唾液酸糖链及中性糖链的峰。特别是，在唾液酸糖链中也检测到箭头所示的唾液酸糖链的峰。
[0327]
[比较例3]
[0328]
(未进行预处理，且不存在脱糖链促进剂时的糖链释放)
[0329]
将20μg的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)溶解于pbs而成的液体用于蛋白a管柱(在单片二氧化硅的表面固定有蛋白a的载体。载体的体积：约5μl。另外，体积中，二氧化硅本身的体积还包括介孔及微孔的体积。)，并用pbs进行了清洗。接着，将0.5mu/ml的
pngase f溶液(takara bio inc.制)1.5μl、0.1m的碳酸氢铵水溶液1.5μl添加到蛋白a管柱，在50℃下进行10分钟的糖链释放反应而使糖链释放。
[0330]
接着，向蛋白a管柱添加10μl的2ab溶液(由50mg的2-氨基苯甲酰胺、60mg的氰基硼氢化钠、300μl的乙酸及700μl的二甲基亚砜混合而成的溶液)，在60℃下进行了2小时的反应。向管中管中放入蛋白a管柱并使用台式离心机进行离心而得到了2ab标记生成物。向所得到的2ab标记生成物中添加乙腈而得到了溶出液。将该溶出液应用于单片二氧化硅旋转柱，清洗之后，用50μl的纯水进行溶出，得到了溶出液。
[0331]
(hplc测定)
[0332]
在上述表1所示的条件下，对所得到的溶出液1μl进行了hplc测定。将所得到的hplc图谱示于图18。如图18所示，未检测到在图17中箭头所示的具有等分glcnac的唾液酸糖链及还包含二唾液酸糖链的峰(图18中箭头所示的峰)。
[0333]
[参考例2]
[0334]
(未进行预处理，以及不存在脱糖链促进剂时的糖链释放)
[0335]
将20μg的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)溶解于pbs而成的液体用于蛋白a管柱(在单片二氧化硅的表面固定有蛋白a的载体。载体的体积：约5μl)，并用pbs进行了清洗。
[0336]
接着，将0.5mu/ml的pngase f溶液(takara bio inc.制)1.5μl和含nls的0.1m的碳酸氢铵水溶液1.5μl添加到蛋白a管柱(nls的最终浓度为0.2质量％、0.4质量％或0.8质量％)，在50℃下进行10分钟的糖链释放反应，使糖链释放。
[0337]
接着，向蛋白a管柱添加10μl的2ab溶液(由50mg的2-氨基苯甲酰胺、60mg的氰基硼氢化钠、300μl的乙酸及700μl的二甲基亚砜混合而成的溶液)，在60℃下进行了2小时的反应。
[0338]
接着，向管中放入蛋白a管柱并使用台式离心机进行离心而得到了2ab标记生成物。向所得到的2ab标记生成物中添加乙腈，得到了溶出液。将该溶出液应用于单片二氧化硅旋转柱，进行清洗之后，用50μl的纯水进行溶出，得到了溶出液。在与比较例3相同的条件下，对所得到的溶出液进行了hplc测定。
[0339]
将所得到的hplc图谱示于图19。如图19所示，尽管在参考例2中未进行肽消化，但也检测出了图17中箭头所示的唾液酸糖链的峰。
[0340]
[实施例16]
[0341]
(进行预处理，以及存在脱糖链促进剂时的糖链释放)
[0342]
将20μg的人igg(sigma-aldrich,co.llc.制)溶解于pbs而成的液体用于蛋白a管柱(在单片二氧化硅的表面固定有蛋白a的载体。载体的体积：约5μl)，并用pbs进行了清洗。
[0343]
接着，作为预处理通入500μl的0.2质量％nls水溶液，然后将0.5mu/ml的pngase f溶液(takara bio inc.制)1.5μl和含nls的0.1m的碳酸氢铵水溶液1.5μl添加到蛋白a管柱(nls的最终浓度为0.2重量％)，在50℃下进行10分钟的糖链释放反应，使糖链释放。
[0344]
接着，向蛋白a管柱添加10μl的2ab溶液(由50mg的2-氨基苯甲酰胺、60mg的氰基硼氢化钠、300μl的乙酸及700μl的二甲基亚砜混合而成的溶液)，在60℃下进行了2小时的反应。
[0345]
接着，向管中放入蛋白a管柱并使用台式离心机进行离心，得到了2ab标记生成物。向所得到的2ab标记生成物中添加乙腈，得到了溶出液。将该溶出液应用并通入单片二氧化
硅旋转柱，进行清洗之后，用50μl的纯水进行溶出，得到了溶出液。从糖链释放反应至得到被标记的游离糖链所花的时间约为3小时。在与比较例3相同的条件下，对所得到的溶出液进行了hplc测定。
[0346]
将所得到的hplc图谱示于图20。如图20所示，尽管在本实施例中未进行肽消化，但也检测到了图17中箭头所示的唾液酸糖链的峰。而且，由于进行了预处理，因此检测到的该唾液酸糖链的峰的强度比参考例2的强。
[0347]
[实施例17]
[0348]
(基于预处理剂浓度的变动的回收率的研究)
[0349]
将在预处理中所使用的nls的浓度变更为0.4重量％或0.8重量％，除此以外，进行与实施例16相同的操作，并利用hplc检测了糖链。
[0350]
将所得到的hplc图谱示于图21。在图21中一同给出了在预处理工序中nls为0质量％的情况(相当于参考例2)和nls为0.2质量％的情况(相当于实施例16)的结果。另外，图22所示的柱状图相对应地表示了图21的每一个hplc中的峰的总面积。如图22所示，通过进行预处理而提高了糖链的回收率。
[0351]
[实施例18]
[0352]
(基于预处理剂量的变动的回收率的研究)
[0353]
将预处理中所使用的nls溶液的nls的浓度设为0.4质量％，将nls溶液的量设为10μl、50μl、200μl或500μl，除此以外，进行了与实施例16相同的操作，并利用hplc检测了糖链。
[0354]
将所得到的hplc图谱示于图23。而且，在表7中给出了所得到的hplc图谱中的序号1至序号7(参考图17)的各峰的面积相对于峰的面积的总和的比率(％)。另外，序号7的峰的面积中包括仅比其稍微延迟而溶出的唾液酸糖链的峰(与序号7的峰重叠检测到的箭头所示的峰)的面积。因此，在表7中，根据序号7的峰面积判断唾液酸糖链的回收率。如表7所示，明确可知尤其是在使用50μl以上量的0.4质量％的nls溶液的情况下，唾液酸糖链的回收率上升。
[0355]
[表7]
[0356]
峰序号10μl50μl200μl500μl10.590.550.550.57223.0522.7422.9722.9236.686.776.406.68440.4840.3140.1040.40516.9816.8817.2517.0862.332.222.402.2479.8910.5210.3210.11
[0357]
根据本发明，能够提供一种从糖蛋白快速制备标记过的糖链的技术。