马铃薯StMYB117基因在花青素合成调控中的应用

马铃薯stmyb117基因在花青素合成调控中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及马铃薯stmyb117基因在花青素合成调控中的应用。


背景技术：

2.马铃薯（solanum tuberosum l.）是仅次于小麦、水稻和玉米的第四大粮食作物，粮、菜、饲和工业原料兼用，营养丰富，适种区域广，增产潜力大，经济效益高。彩色马铃薯除了含有一般马铃薯所含有的淀粉、蛋白质、多种微量元素和氨基酸外，其抗氧化活性是白肉或黄肉马铃薯的3-5倍（brown et al., 2003），其中抗氧化活性物质主要是花青素。花青素是植物次生代谢过程中产生的类黄酮物质，广泛存在于植物的花、果实、种子、茎、叶和根的细胞液中，使其呈现从红、紫到蓝等不同的颜色（brenda, 2002）。花青素作为一种具有天然生物活性的植物色素，不仅具有强抗氧化性，其在营养器官中的合成和积累对植物适应和抵抗恶劣环境条件至关重要，可以增强植物对不同生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力（王鸿雪等，2020；zhang et al., 2018; chen et al., 2016）。花青素的合成途径比较明确，需要一系列酶的参与（holton and cornish, 1995; liu et al., 2018），如chs（查尔酮合酶基因）、chi（查尔酮异构酶基因）、f3h（黄烷酮-3-羟基化酶基因）、f3’h（类黄酮3
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羟化酶）、f3
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h（类黄铜3
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羟化酶）、fls（黄酮醇合成酶）、dfr（二氢黄酮醇还原酶基因）、ans（花青素合成酶）、3gt（类黄酮3-o-葡萄糖基转移酶）、gst（谷胱甘肽s-转移酶）等。这些酶基因的表达主要受转录因子的调控，目前研究比较多的是由myb, basic helix-loop-helix (bhlh) 和 wd40-repeat (wdr) 蛋白组成的mbw蛋白复合体对花青素合成的调控（grotewold, 2006），其中myb转录因子起主要调控作用。
3.myb基因家族作为植物界最大的转录因子家族之一，在植物中发挥着重要作用，包括次生代谢，激素信号传导与环境因子应答和对内外环境胁迫的反应等（gao et al.,2017）。myb是螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix）结构，根据其dna结构域的特点，myb转录因子大致分为4类：(1)包含1个r结构，即1r-myb/myb-related；(2)包含2个r结构，即r2r3-myb；(3)包含3个r结构，即r1r2r3-myb；(4)包含4个r结构，即4r-myb（ambawat et al.,2013），植物中绝大多数转录因子均属于r2r3-myb。在烟草中过表达psmyb58，花青素合成途径中的结构基因明显上调，进而增强花青素在不同器官中的积累。烟草中过表达stan2 和 stbhlh1(或 stjaf13)比单独过表达stan2表现出更强烈的紫色色素沉着。在杨梅中，mrmyb1与mrwd40-1 和 mrbhlh1 相互作用，以形成 mbw 复合体的形式来调节杨梅中花青素的积累（liu et al.,2013）。在园艺作物中，苹果 mdmyb10（espley et al.,2007）、mdmyb1（li et al.,2012） 和mdmyb110a（umemura et al.,2013），草莓 famyb10和 pymyb114（yao et al.,2017） 已经被报道通过形成 mbw 复合体调节花青素的合成。
4.在马铃薯中，已经明确功能的myb转录因子还不是很多。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的一在于提供马铃薯stmyb117基因在花青素合成调控中的应用，目的二在提供种促进马铃薯花青素合成的方法。所述stmyb117基因是筛选花青素合成相关转录组中的差异表达基因得到的，将该基因在马铃薯中超量表达，能有效提高促进花青素的合成，提高马铃薯块茎中的花青素含量。
6.本发明采用的具体方案如下：本发明第一方面请求保护马铃薯stmyb117基因在花青素合成调控中的应用，所述stmyb117基因的长度为1290bp，核苷酸序列如seq id no：01所示；编码429个氨基酸，氨基酸序列如seq id no：02所示。
7.本发明的第二方面请求保护一种促进马铃薯花青素合成的方法，所述方法是在马铃薯块茎中超量表达stmyb117基因。具体包含以下步骤：首先构建包含stmyb117的植物表达载体，然后转化农杆菌，经验证正确后转染马铃薯，获得转基因株系。优选地，所述植物表达载体为psak-stmyb117。
8.有益效果：1、本发明的stmyb117基因是从马铃薯基因型maclntosh black块茎（紫皮紫肉表型）cdna中克隆得到。利用不同表型块茎样品对stmyb117基因进行表达模式分析，发现该基因在红色和紫色基因型块茎中的表达量显著高于白色和黄色基因型块茎。稳定转化马铃薯后发现，发现该基因可以激活下游结构基因的表达，进而促进花青素的合成；2、为培育高花青素含量马铃薯（植物）新品种提供了基因和载体资源。
附图说明
9.图1是stmyb117基因在不同表型块茎中的表达模式对比图；图2是超量表达stmyb117基因的组培苗中stmyb117基因表达量分析图；图3是超量表达stmyb117基因的转基因块茎表型鉴定图；图4是超量表达stmyb117基因的转基因块茎花青素含量图；图5是超量表达stmyb117基因的转基因块茎中stmyb117的表达模式分析图；图6是超量表达stmyb117基因的转基因块茎中花青素合成相关基因的表达模式分析图。
具体实施方式
10.本发明涉及的stmyb117基因是筛选花青素合成相关转录组中的差异表达基因得到的。通过分析stmyb117在不同表型马铃薯块茎中的表达模式，发现该基因的表达与块茎中花青素含量相关。通过构建超量表达载体，稳定转化马铃薯，结果显示转基因块茎中花青素含量上升，结构基因stchs、stf3h、stf3
’5’
h、stgst的表达量显著升高。因此，从马铃薯中分离stmyb117基因并鉴定其在花青素合成过程中的作用，对于培育高花青素含量马铃薯新品种具有重要意义。
11.本发明从马铃薯macintosh black基因型块茎中克隆得到myb基因成员stmyb117。其orf序列全长1290bp（核苷酸序列如seq id no：01所示），编码429个氨基酸（氨基酸序列如seq id no：02所示）。将该基因在马铃薯中超量表达，能有效促进花青素的合成，提高马
铃薯块茎中的花青素含量。
12.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
13.1、stmyb117基因的表达分析。
14.本发明中的stmyb117基因是在花青素合成相关转录组差异基因中得到，利用不同表型块茎对该基因进行表达分析，发现该基因在红色和紫色基因型块茎中的表达量显著高于白色和黄色基因型块茎。
15.6个不同表型基因型块茎，maclntosh black和congo块茎是紫皮紫肉，redsen和华薯1号块茎是红皮黄肉，华恩1号和393160-4块茎是黄皮黄肉。分别以这6种基因型块茎表皮样品cdna为模板对stmyb117进行real-time pcr表达分析。real-time pcr按照takara公司的sybr premix ex tm
taq ii 试剂盒进行操作。反应体系为： sybr mix 12.5 μl，正反向引物各1 μl，模板1 μl，灭菌蒸馏水补齐至25 μl。反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 5 min。stmyb117正向引物为5
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agcaactcctagtagcacca
ꢀ‑3’
，反向引物为5
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tccctttgcctatcccaaga
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。stef1α作为内参基因，正向引物为5
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attggaaacggatatgctcca-3’，反向引物为5
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tccttacctgaacgcctgtca-3’。pcr反应在bio-rad 公司的icycler iq5 real-time pcr 仪上进行。用2
‑△△
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法对不同样品中stmyb117基因的相对表达量进行规一化。
16.2、stmyb117基因克隆及表达载体构建。
17.以马铃薯macintosh black的块茎cdna为模板，以5
’‑ꢀ
tagtggatccaaagaattcatgtcatcaacatcatcatcttgtt-3’为正向引物，5
’‑ꢀ
cgagaagctttttgaattctcaagtggctcctactccaagaaag-3’为反向引物，扩增stmyb117基因。将基因片段利用ligation-free cloning kit试剂盒与植物表达载体psak-277（ecorⅰ单酶切）重组，重组反应体系：3
µ
l 目的基因回收产物，2
µ
l psak-277(切)，2
µ
l 5
×
master mix，3
µ
l dh2o。将配好的反应体系放置在冰盒中冰浴30min进行重组，然后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。经spe抗生素筛选，挑取单克隆摇菌，阳性克隆送公司测序，形成植物表达载体psak-stmyb117。提取psak-stmyb117载体质粒，转化农杆菌gv3101，经spe和rif抗生素筛选，得到阳性克隆，为植物表达载体psak-stmyb117农杆菌。
18.3、马铃薯遗传转化。
19.将含有重组植物表达载体psak-stmyb117的农杆菌在lb平板划线培养（含50 mg/l的spe，50 mg/l的rif），置于28℃条件下培养48 h；挑取单克隆在20 ml yeb液体培养基中，28℃，250r/min条件下培养24 h；取1 ml菌液转移至50 ml新鲜的lb液体培养基中，28℃，250r/min条件下继续培养，至菌液od600达到0.6左右。转移菌液至离心管中，室温条件下，5000r/min离心10min，收集沉淀，重悬于ms培养基中。将生长8-12周，直径为0.5cm的desiree试管薯切成1-2mm的薄片，在ms重悬液中浸泡5-10 min，取出后用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共生培养基（ms+0.2 mg/l iaa+0.5 mg/l ba+0.2 mg/l ga3+2 mg/l zt），26℃按培养2天，转移到再生培养基中（ms+0.1 mg/l iaa+2 mg/l zt+60 mg/l kan+200 mg/l cef）。在光照强度为2000lx，光周期16h/d，温度25
±
1℃条件下培养。3-4周后，从试管薯中央长出抗性芽，当抗性芽长至0.5-1cm时，剪下在添加50 mg/l 卡那霉素和400 mg/l卡苄西林的ms培养基上生根。利用npt ii基因引物筛选转基因植株。获得的转基因株系采用实时荧光定量pcr分析stmyb117基因的表达水平。将转基因植株和对照植株种植在直径为24厘
米的营养钵中，温度控制在20-25℃。温室培养80天后收获。
20.4、花青素含量测定。
21.花青素含量的测定采用分光光度ph示差法（zhang et al.,2009）。用甲醇-盐酸溶液(甲醇与0.05 mol l
−
1hcl按85:15比例混合)从 0.5克块茎中提取花青素，用分光光度计(uv-2550，日本岛津)在530 nm和700 nm处测定提取物的吸光度。吸光度(abs) s=(a530 nm
–
a700 nm)ph1.0
–
(a530 nm
–
a700 nm)ph4.5 。总的花青素含量（tac）计算公式参照先前所述（liu et al.,2016）。每个样品进行3次生物学重复。
22.5、结果分析。
23.（1）stmyb117基因的表达分析。
24.检测stmyb117基因在不同表型块茎皮中的表达模式，结果显示该基因在紫皮（macintosh black和congo）和红皮（redsen和华薯1号）块茎中的表达量显著高于黄皮块茎（华恩1号和393160-4）（图1）。
25.（2）马铃薯块茎中stmyb117基因的功能分析。
26.为了探究stmyb117基因在马铃薯花青素积累中的作用，将超量表达载体转化到马铃薯desiree中。获得6个转基因株系，与对照相比，这些转基因株系组培苗中stmyb117的表达量升高（图2）。选择3个表达量较高的转基因株系（oe-2、oe-4和oe-7）进行进一步研究。
27.转基因株系的块茎在生长80天后采收，desiree的块茎呈浅粉色，而stmyb117转基因块茎的块茎皮比desiree的颜色更深，其中stmyb117-4的部分块茎肉明显变红（图3）。进一步对转基因块茎中基因转录水平和花青素含量进行分析，发现3个转基因株系与对照相比，stmyb117基因的转录水平显著提高（图4）。对其进行花青素含量测定，发现转基因块茎中花青素含量显著升高（图5）。进一步对花青素合成过程中的结构基因表达量分析，发现stchs、stf3h、stf3
’5’
h、stgst的表达量与对照相比显著升高（图6）。
28.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。