一种与绿豆耐碱性钙质土胁迫基因共分离的InDel分子标记

一种与绿豆耐碱性钙质土胁迫基因共分离的indel分子标记
技术领域
1.本发明涉及分子生物学和遗传学领域，特别是涉及一种与绿豆耐碱性钙质土胁迫基因共分离的indel分子标记。


背景技术：

2.绿豆(vigna radiata l.)是我国重要的豆科作物，绿豆籽粒富含蛋白质、碳水化合物、维生素和微量元素，叶片茎秆可用作饲料或绿肥，绿豆根部通过根瘤菌共生可以起到固氮作用，具有养地的功能，深受消费者的喜爱。然而绿豆作为小宗作物，往往得不到优先种植，分配到的土壤条件较差，其中大部分为石灰质土壤。石灰质土壤是指地表15cm以下土层中，碳酸钙含量在15％以上的土壤，世界上约有30％的耕地是石灰质土壤，我国华北和西北存在大量石灰质土壤。石灰质土壤在雨水的作用下发生水解并产生游离的碳酸氢根阴离子，引起土壤的碱化并导致土壤中的游离态金属离子(如fe
3+
和zn
2+
)被沉淀或螯合，使得植物可吸收利用的金属元素含量显著降低，在石灰质土壤中，可利用铁元素仅能提供植物正常生长所需铁元素的0.1-10％，导致植物叶片发黄，产生缺铁失绿症。
3.随着高通量测序技术的发展，基于全基因组重测序的插入/缺失多态性标记(insertion/deletion,indel)越来越受到关注，indel标记具有在基因组内分布广泛、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等优点。随着基因组学及生物信息学的的发展，大量公共数据如est、cdna和基因组序列等信息大量出现，使得通过生物信息学方法可得到候选indel成为可能。indel标记属于共显性标记，具有较好的稳定性和较为丰富的多态性，然而在鉴定绿豆耐碱性钙质土壤种质资源方面却没有相关的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种与绿豆耐碱性钙质土胁迫基因共分离的indel分子标记，以解决上述现有技术存在的问题，本发明公开的绿豆indel分子标记可以节省育种时间，加快育种进程，降低育种成本，整个检测过程操作简单且准确性高，极大地降低了工作周期和成本。
5.为实现上述目的，本发明提供一种与绿豆耐碱性钙质土胁迫基因vrh
+-atpase
nm
共分离的indel分子标记，所述indel分子标记为seq id no：6所示的核苷酸序列片段，共281bp；所述seq id no：6所示的核苷酸序列片段与耐碱性钙质土胁迫基因vrh
+-atpase
nm
共分离。
6.本发明还提供一种所述的indel分子标记的cst-indel引物组，所述cst-indel引物组包含两条特异性引物，核苷酸序列如seq id no：3-4所示。
7.本发明还提供一种含有所述的indel分子标记或所述的cst-indel引物组的试剂盒。
8.本发明还提供一种根据所述的indel分子标记或所述的cst-indel引物组或所述的试剂盒在绿豆育种中的应用。
9.本发明还提供一种根据所述的indel分子标记或所述的cst-indel引物组或所述的试剂盒在快速筛选绿豆耐碱性钙质土胁迫材料中的应用。
10.本发明还提供一种筛选耐碱性钙质土胁迫绿豆品种的方法，以待测绿豆样品的基因组dna作为模板，利用所述的cst-indel引物组对模板进行扩增，扩增结果为281bp时，所述绿豆品种耐碱性钙质土胁迫。
11.进一步的，所述方法的具体步骤为：
12.(1)绿豆亲本与品种nm-12-10杂交获得的后代，提取dna；
13.(2)利用cst-indel引物组对步骤(1)中的dna进行pcr扩增，获得pcr产物；
14.(3)所述pcr产物进行电泳检测，通过电泳条带大小鉴定待测样品是否为耐碱性钙质土胁迫绿豆品种。
15.进一步的，所述电泳检测在电泳槽中进行。
16.本发明公开了以下技术效果：本发明针对来自品种nm-12-10的vrh
+-atpase
nm
是一个显性稀有基因的片段缺失，开发了共分离标记cst-indel，该引物扩增产物在nm-12-10和其他品种间会产生条带大小的差异，从而准确的在苗期鉴定出携带vrh
+-atpase
nm
的个体，节省育种时间，加快育种进程，降低育种成本，整个检测过程操作简单且准确性高，极大地降低了工作周期和成本。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为重组自交系82、110、7、12的扩增结果，其中，由左往右泳道1为marker；泳道2为kps2的扩增带型；泳道3为nm-12-10的扩增带型；第4和第5泳道为家系82和家系110的扩增条带；第6和第7泳道为家系7和家系12的扩增条带；
19.图2为碱性钙质土壤上种植82、110、7、12四个家系的表型结果。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
22.高耐碱性钙质土胁迫的品种nm-12-10与不耐碱性钙质土胁迫绿豆品种kps2均由泰国学者prakit somta提供，这2个品种来源于亚蔬—世界蔬菜中心的种质资源库。
23.实施例1基于绿豆vrh
+-atpase
nm
基因的indel标记的开发
24.在研究工作中，本发明的发明团队筛选到一个高耐碱性钙质土胁迫的绿豆品种nm-12-10，通过图位克隆的方法，将相关基因定位在第6染色体上，并获得了候选基因
vradi06g12260，编码一个质膜质子泵蛋白，因此我们将该基因命名vrh
+-atpase。
25.来自品种nm-12-10的vrh
+-atpase
nm
是一个显性稀有基因，普通型vrh
+
atpase全长序列如seq id no：1所示，耐碱性钙质土型vrh
+
atpase
nm
全长序列如seq id no：2所示：
26.seq id no：1：(下划线为启动子区域，阴影部分为外显子区域)
27.28.29.[0030][0031]
seq id no：2：
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036][0037]
通过测序发现vrh
+-atpase
nm
的启动子上有一处20bp的缺失，本发明根据耐碱性钙质土品种nm-12-10中vrh
+-atpase
nm
基因启动子上的20bp缺失，设计了一对特异引物，核苷酸序列如下所示：
[0038]
cst-indel-f：5'-agtgatgtccccaacgaa-3'(seq id no：3)
[0039]
cst-indel-r:5'-tagtgtccaccccacaaac-3'(seq id no：4)。
[0040]
根据不耐碱性钙质土胁迫绿豆品种kps2序列的扩增产物片段长度为301bp，序列如seqid no：5所示(下划线表示nm-12-10中缺失的20bp):
[0041]
agtgatgtccccaacgaaatttgggtatgtaaaaaacatttttttcccggtaaataccagattattttatagagctatatttgactttattttagaaacaaaattccatgcaatagttatagaaatttcagcagaaattaagatttgcttcaatagataaactaattcaaaacttttaaagagtagggtgagtaaaaaaaaagtatttgtcaaggaagatatattaatgaaatattcattttaattttctctggtattattttactctatttttaatgattagtttgtggggtggacacta；
[0042]
根据耐碱性钙质土胁迫绿豆品种nm-12-10的序列的扩增产物片段长度为281bp，序列如seq id no：6所示:
[0043]
agtgatgtccccaacgaaatttgggtatgtaaaaaacatttttttcccggtaaataatatttgactttattttagaaacaaaattccatgcaatagttatagaaatttcagcagaaattaagatttgcttcaatagataaactaattcaaaacttttaaagagtagggtgagtaaaaaaaaagtatttgtcaaggaagatatattaatgaaatattcattttaattttctctggtattattttactctatttttaatgattagtttgtggggtggacacta；
[0044]
在丙烯酰胺凝胶电泳中可以观察到条带大小的差异，由此产生多态性。经过该标记筛选出携带vrh
+-atpase
nm
的个体在碱性钙质土壤上表现为耐性，该标记被命名为cst-indel。
[0045]
实施例2cst-indel分子标记在绿豆耐碱性钙质土后代选育上的应用
[0046]
(1)群体扩增检测及标记分析：不耐碱性钙质土亲本kps2和耐碱性钙质土亲本nm-12-10杂交得到f1代种子，种植后得到f1代单株，f1代单株自交结实收获得f2代种子共122粒，将122粒f2种子种下后，利用单籽传法连续自交5代，得到122个重组自交系。
[0047]
采用ctab法分别提取所有自交系的基因组dna：在苗期，选择重组自交系的新鲜叶片，液氮迅速冷冻后，碾磨，采用ctab法提取样品总dna。利用cst-indel引物(seq id no：3-4)对样品总dna进行pcr扩增，选用mix master dna聚合酶(北京擎科)进行扩增，保证pcr产物条带的单一。
[0048]
pcr体系(10μl)：
[0049][0050]
pcr反应程序：94℃预变性3分钟；95℃变性10秒，55-58℃退火15秒，72℃延伸30秒，循环32-37次；72℃最后延伸1分钟，扩增产物4℃保存。
[0051]
扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶配方如下：称取57g丙烯酰胺，3g n',n'-亚甲双丙烯酰胺和420.42g尿素溶解于500ml的ddh2o中，最后定容至1000ml。10
×
tbe是将108g的tris碱和55g的硼酸先溶解于蒸馏水，加40ml 0.5mol/l的edta(ph 8.0)，再加ddh2o定容到1000ml；19:1(100ml)丙烯酰胺是将38g丙烯酰胺和2g n',n'-亚甲双丙烯酰胺溶解于ddh2o，定容至100ml，过滤后4℃保存。
[0052]
电泳采用600v恒压电泳，选用dyy-6e型电泳仪电源(北京六一)和jy-cx2b型电泳槽(北京君意)，注意灌胶过程中缓慢耐心，以免气泡的产生。待胶完全凝固后，用10μl量程的移液器(北京大龙兴创)加样，上样，上样量为2.5μl，电压为220v，电泳时长80-100分钟，电泳后取出凝胶进行银染及显色。
[0053]
银染：凝胶用ddh2o反复洗净；加入足够没过凝胶的银染液(0.2％硝酸银水溶液)；摇床上轻摇20分钟左右，然后倒掉银染液，用蒸馏水漂洗2次。
[0054]
显色：加入相同体积的显色液(1.5％氢氧化钠水溶液，0.4％饱和甲醛)，轻摇至条带清晰；取出胶板，用蒸馏水清洗，在灯箱上读取带型，分析条带。
[0055]
(3)结果与分析：在kps2和nm-12-10的重组自交系基因型的检测中，发现家系82和家系110的条带在280bp左右，家系7和家系12条带在300bp左右。如图1所示，泳道1为marker，最低条带大小为100bp，倒数第二条带为250bp，倒数第三条为350bp。泳道2为kps2的扩增带型，片段大小为301bp，泳道3为nm-12-10的扩增带型，片段大小为281bp，第4和第5泳道为家系82和家系110的扩增条带，第6和第7泳道为家系7和家系12的扩增条带。
[0056]
在碱性钙质土壤上种植四个家系，结果显示家系82和家系110高度耐碱性钙质土胁迫，能够正常生长，而家系7和家系12则出现严重的缺铁失绿症(如图2所示)，这说明cst-indel标记能够准确的鉴定耐碱性钙质土的材料。
[0057]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。