一种融合基因PML-RARα检测用试剂盒及其检测方法与应用与流程

一种融合基因pml-rar
α
检测用试剂盒及其检测方法与应用
技术领域
1.本发明涉及急性骨髓性白血病检测技术领域，尤其涉及一种融合基因pml-rarα检测用试剂盒及其检测方法与应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，aml)，是一种骨髓性白细胞(而非淋巴性白细胞)异常增殖的血癌，以面色苍白、发热、身困无力为主要特征，还伴有心悸、气短、胸胁压痛、关节疼、皮肤呈现少量致密出血点等症状。aml患者一般携带有非随机、重现性的染色体异常；who的血液肿瘤与淋巴瘤分类中指明，aml患者特异性的染色体异常在诊断、治疗、预后以及治疗后的监测起着非常重要的作用。
4.t(15；17)(q22；q21)是aml患者中常见的细胞遗传学异常，产生新的融合基因pml-rarα，pml-rarα存在于约95％以上的aml-m3患者中。pml-rarα融合基因是转录激活基因，导致细胞增殖速度加快，临床上t(15；17)主要与m3型密切相关。
5.依据pml基因断裂点的不同，pml-rarα融合基因可分为bcr1(long，l)，bcr2(variant，v)和bcr3(short，s)三种亚型。临床上，pml-rarα融合基因的检测可以辅助对急性骨髓性白血病的诊断，也可作为m3诊断分型的标志、药物治疗的疗效监控以及用于监测患者的微小残留(mrd)。但是目前市面上常用的pml-rarα融合基因检测用试剂盒存在灵敏度低，稳定性差的问题。


技术实现要素：

6.针对上述的问题，本发明提供一种融合基因pml-rarα检测用试剂盒及其检测方法与应用，该试剂盒能够结合实时荧光pcr技术，对外周血或骨髓血样本中提取的rna中融合基因pml-rarα定量检测。该试剂盒灵敏度高，稳定性好。为实现上述目的，本发明公开如下的技术方案：
7.在本发明的第一方面，公开一种融合基因pml-rarα检测用试剂盒，其包括pml-rarα反应液、内参基因pcr反应液、混合酶液、对照品试剂。
8.进一步地，所述pml-rarα反应液、内参基因pcr反应液、混合酶液的混合比例为3～4：3～4：1，三者混合后得到预混液。
9.进一步地，所述混合酶液为无核酸酶水。
10.进一步地，所述pml-rarα反应液包括：pml-rarαl型试剂、pml-rarαs型试剂和pml-rarαv型试剂。
11.进一步地，所述pml-rarαl型试剂包括如下比例的组分：10.0μlaceq u+probe master mix、0.06μl曲拉通100、0.04μl 1，2-丙二醇、0.4μlrox内参、0.6μl pml-rarαl型上
游引物、0.6μl pml-rarα下游引物、0.4μl pml-rarα探针、3.0μl无核酸酶水；其中pml-rarαl型上游引物的序列为sed id no.1所示的核苷酸序列。
12.进一步地，所述pml-rarαs型试剂包括如下比例的组分：10.0μlaceq u+probe master mix、0.06μl曲拉通100、0.04μl 1，2-丙二醇、0.4μlrox内参、0.6μl pml-rarαs型上游引物、0.6μl pml-rarα下游引物、0.4μl pml-rarα探针、3.0μl无核酸酶水；其中pml-rarαs型上游引物的序列为sed id no.2所示的核苷酸序列。
13.进一步地，所述pml-rarαv型试剂包括如下比例的组分：10.0μlaceq u+probe master mix、0.06μl曲拉通100、0.04μl 1，2-丙二醇、0.4μlrox内参、0.6μl pml-rarαv型上游引物、0.6μl pml-rarα下游引物、0.4μl pml-rarα探针、3.0μl无核酸酶水；其中pml-rarαv型上游引物的序列为sed id no.3所示的核苷酸序列。
14.所述pml-rarα下游引物的序列为sed id no.4所示的核苷酸序列
15.进一步地，所述对照品试剂包括如下比例的组分：10.0μl aceq u+probe master mix、0.4μl rox内参、0.6μl abl1上游引物、0.6μl abl1下游引物、0.4μl abl1探针、3.0μl无核酸酶水；其中abl1上游引物的序列为sed id no.5所示的核苷酸序列；abl1下游引物的序列为sed id no.6所示的核苷酸序列；所述abl1探针的序列为sed id no.7所示的核苷酸序列。
16.进一步地，所述内参基因pcr反应液包括：3μl pcr反应液+10μlpml-rarαmix反应液+3μl pml-rarα酶液。
17.在本发明的第二方面，公开所述试剂盒在检测外周血或骨髓血样本中融合基因pml-rarα中的应用。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：实时荧光pcr技术指的是在pcr进行的同时，对其过程进行监测(即实时)。因此，数据可在pcr扩增过程中，而非pcr结束之后，进行收集。而本发明的这种试剂盒能够与实时荧光pcr技术结合，实现对外周血或骨髓血样本中提取的rna中的融合基因pml-rarα进行定量检测，而且具有灵敏度高、稳定性好、检测快速的特点。
具体实施方式
19.在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
20.除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。
21.正如前文所述，pml-rarα融合基因的检测对于急性骨髓性白血病患者特异性的染色体异常在诊断、治疗、预后以及治疗后的监测起着非常重要的作用。为此，本发明提出了一种融合基因pml-rarα检测用试剂盒，现根据具体实施方式对该试剂盒进一步说明。
22.本发明所使用的pml-rarαl型上游引物的序列为sed id no.1所示的核苷酸序列；pml-rarαs型上游引物的序列为sed id no.2所示的核苷酸序列；pml-rarαv型上游引物的序列为sed id no.3所示的核苷酸序列；pml-rarα下游引物的序列为sed id no.4所示的核
苷酸序列；abl1上游引物的序列为sed id no.5所示的核苷酸序列；abl1下游引物的序列为sed id no.6所示的核苷酸序列；所述abl1探针的序列为sed id no.7所示的核苷酸序列；内参基因的上游引物序列为seq id no:8所示的核苷酸序列、下游引物为seq id no:9所示的核苷酸序列、探针为seq id no:10所示的核苷酸序列；具体见表1：
23.表1
[0024][0025][0026]
实施例1
[0027]
一种采用试剂盒检测外周血中提取的rna中融合基因pml-rarα的方法，包括如下步骤：
[0028]
(1)外周血标本获取：初诊患者在治疗前留取标本，外周血白细胞计数正常的患者，抽取5～8ml外周血(也可以抽取2～4ml骨髓作为检测样本)，如果血液中白细胞计数升高或偏低，可以适当调整标本采集量(有核细胞总数需达到5x106以上)，标本存放在edta抗凝管中。
[0029]
(2)环境要求：环境温度18～25℃、湿度10～75％。
[0030]
(3)rna提取：参考现有的rna提取方法即可。
[0031]
(4)试剂准备：引物、探针到货后存储在-80℃冰箱中，配制前中取出放在准备区(-20℃冰箱)暂存。引物探针从冰箱取出后，12000rpm离心2min使管壁上的干粉聚集到底部，
[0032]
配制时，试剂提前在室温下自然融化，打开时在试剂瓶上标注开瓶日期、开瓶人，使用后标记使用份数，将各组分加入试管后振荡混匀，微离心。
[0033]
表2对照品试剂配制表
[0034][0035]
表3 pml-rarαl型试剂配制表
[0036][0037][0038]
表4 pml-rarαs型试剂配制表
[0039][0040]
表5 pml-rarαv型试剂配制表
[0041][0042]
表6内参基因pcr反应液配制表
[0043][0044][0045]
所述用于检测内参基因的pcr反应液包括由seq id no:8所示的上游引物、由seq id no:9所示的下游引物和由seq id no:10所示的探针。
[0046]
(5)预混液配制：吸取pml-rarαl型反应液8μl、pml-rarαs型反应液8μl、pml-rarαv型反应液8μl、内参基因pcr反应液24μl、混合酶液(无核酸酶水)6μl，将上述三种试剂混合均匀，得到预混液，将其分装在试管中。
[0047]
(6)加样：从上述的对照品试剂、标本(外周血)中分别取样15μl，向每组预混液的两支试管中分别加入所述对照品试剂、标本，盖紧管盖、将其移至检测区。
[0048]
(7)pcr扩增：将步骤(6)配样完成后的试管置于荧光pcr检测仪(型号：abi 7500)中，反应程序设置如下：42℃反应30min；94℃反应5min；(94℃反应15s；60℃反应60s)40个循环，并在pcr循环第二步60℃时收集荧光信号。检测通道和参比荧光：测仪检测通道为fam-tamra、参比荧光设定为none，其他未说明的测试条件、步骤等可参考现有的融合基因
pml-rarα检测方法，本实施例不再赘述。
[0049]
实施例2
[0050]
一种采用试剂盒检测外周血中提取的rna中融合基因pml-rarα的方法，步骤同实施例1，区别在于：在预混液配制中，所述pml-rarα反应液、内参基因pcr反应液、混合酶液的比例为3：3：1，具体地，所述pml-rarα反应液、内参基因pcr反应液、混合酶液分别取12μl、12μl、4μl；所述pcr反应液由4μl pml-rarαl型反应液、4μl pml-rarαs型反应液、4μl pml-rarαv型反应液组成。
[0051]
对比例1
[0052]
一种用试剂盒检测pml-rarα融合基因的方法，同实施例1，区别在于，pml-rarαl型试剂配制、pml-rarαs型试剂配制、pml-rarαv型试剂配制各组分结果如表7-表9：
[0053]
表7 pml-rarαl型试剂配制表
[0054][0055]
表8 pml-rarαs型试剂配制表
[0056][0057]
表9 pml-rarαv型试剂配制表
[0058][0059]
结果分析
[0060]
(1)有效性判定：加入对照品的样品的ct值应≤36，标准曲线拟合度绝对值应≥0.980，阴性对照的ct值应≥38或显示”undet”；强阳性对照ct值应≤32；临界阳性对照ct值应大于强阳性对照的ct值，且≤36。
[0061]
表10
[0062][0063]
b.对于内参反应液ct值》36且pml-rarαl/s/v反应液ct值》36的标本，需对该样本加大取样量，重新抽提后进行pcr检测，结果判定按表10进行判定。如仍出现内参反应液ct值》36且pml-rarαl/s/v反应液ct值》36的情况，则判定样本不符合要求。
[0064]
(2)定量判定：
[0065]
在标本pml-rarαl/s/v融合基因为阳性且pml-rarαl/s/v和内参基因检测浓度均大于等于1
×
102copies时，进行下列定量结果分析。
[0066]
参照品在pml-rarαl/s/v中分别设定1
×
106copies、1
×
105copies、1
×
104copies，在扩增结束后，用获得的相应两条标准曲线，分别得到各标本pml-rarαl/s/v的检测浓度(a)和内参基因的检测浓度(b)。
[0067]
若标本：pml-rarαl/s/v rna检测浓度》1
×
107copies，应不在线性范围内，需酌情适当稀释后重测。
[0068]
若标本：1
×
102copies≤pml-rarαl/s/v rna检测浓度≤1
×
107copies，则报告为pml-rarαl/s/v的检测浓度(即a)和内参基因的检测浓度(b)的比值即(a/b)
×
100％。
[0069]
当本试剂盒在检测最小残留病灶时，为了能检测到低至万分之一的融合基因，对于治疗后的病人，其内参基因ct值必须小于23。
[0070]
为了精确定量，在内参基因ct值小于21时，将rna原液进行融合基因检测，原液稀释100倍后进行内参基因检测，以保证相应检测基因的浓度均在线性范围内，此时报告为融合基因的检测浓度(a)和内参基因的检测浓度(b)的比值即(a/b)
×
1％。
[0071]
检测结果如下表11所示。
[0072][0073]
从上述结果可以看出，本发明提出的这种试剂盒能够与实时荧光pcr技术结合后实现对外周血或骨髓血样本中提取的rna中的融合基因pml-rarα进行定量检测，而且这种试剂盒与实时荧光pcr技术配合后具有灵敏度高(最低检出限《100copies)、检测快速、检测结果准确的特点，有助于为急性骨髓性白血病的检测、治疗、预后以及治疗后的监测提供重要的依据。
[0074]
质控品符合率：把实施例1和对比例1所制备的试剂盒在-20℃避光保存50天后，分别10份对质控品进行检测，可以发现：实施例1所制备的试剂盒检测准确率为100％，对比例1所制备的试剂盒检测准确率为80％。
[0075]
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的权利要求为准。