一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法与流程

本技术涉及外泌体提取的，尤其是涉及一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法。

背景技术：

1、外泌体是由各种活体细胞分泌的大小约为30～150nm之间，密度在1.13～1.19g/ml之间的脂质双层膜囊泡状结构小体，与质膜融合后，以胞吐形式释放到细胞外环境中。当外泌体与靶细胞接触后，外泌体及其携带的生物分子(如功能性的脂类、蛋白质，信使rnas(mrnas)、micrornas等分子)以胞吞的形式被接收并发挥作用。

2、目前，外泌体的提取方法主要有差速离心法、超滤法和沉淀试剂盒法。差速离心法主要通过低速离心、高速离心交替进行，实现外泌体的提取，该方法虽然操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定，纯度也受到质疑，此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。超滤法为膜过滤和离心相结合，方法简单高效也不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度偏低的问题。沉淀试剂盒法主要通过沉淀剂与疏水性蛋白和脂质分子结合形成共沉淀，实现外泌体的提取，该方法虽然操作比较简单、成本较低，但是专一性不高，因其能够同时沉淀高丰度和低丰度的蛋白质，导致低丰度的蛋白质损失，进而降低外泌体的提取效率。

3、上述提取方法，不仅需要配合相应的设备进行，而且对操作人员的专业性要求较高，与此同时人工参与的步骤不少，不仅效率较低，还容易引入人为误差。因此需要一种能够实现全自动的提取工艺，以降低人为误差和提升提取效率和准确性。

技术实现思路

1、为了改善现有外泌体提取方法步骤繁多导致的提取效率低，准确率低的缺陷，本技术提供一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法。

2、本技术提供的一种使用全自动提取仪提取外泌体的方法，采用如下的技术方案：包括以下步骤：

3、s1实验准备，将样本和物料承载介质放置在全自动提取仪的物料准备区；

4、s2过滤分离，通过物料转移机构将物料承载介质转移到样本加样区，再通过物料转移机构将样本移至物料承载介质中；再通过物料转移机构将装载有样本的物料承载介质移至加压过滤区；加压组件向装载有样本的物料承载介质内充气加压，使样本过滤，得到滤液a；

5、s3提取操作，通过物料转移机构更换物料承载介质，并向滤液a加入反应试剂进行若干次反应处理，再经若干次加压过滤，最终得到滤液f；所述滤液f为外泌体。

6、通过采用上述技术方案，除样本和承载物料准备外，其他提取过程全部采用全自动机械化，没有人工的参与，既提高了效率，又保证了提取过程的卫生，降低了样本交叉感染风险和人为误差，同时保证样本提取结果的一致性。

7、可选的，步骤 s1中实验准备步骤包括：组装物料承载介质，所述物料承载介质包括过滤件和收集件，将所述过滤件套接在收集件中。

8、通过采用上述技术方案，在手动提取外泌体时，每次过滤均需要更换漏斗、滤膜和接收器，操作繁琐并且容易混淆；通过过滤件和收集件组合形成物料承载介质，能够降低操作误差，提升过滤提取效率。

9、可选的，所述过滤件和收集件上各自布置有若干孔穴，其中过滤件上的孔穴和收集件上的孔穴一一对应；所述过滤件孔穴底部设有过滤膜；在加压组件的气压压力作用下，过滤孔穴内的液体能够通过过滤膜过滤并转移到收集件的孔穴内。

10、通过采用上述技术方案，由于过滤件和收集件上各自布置有若干孔穴，并且过滤件的孔穴与收集件的一一对应，因此一个物料承载介质可以同时供多个不同样本进行提取操作，进一步提升过滤提取效率。

11、可选的，所述步骤s4提取操作具体包括第一次提取、第二次提取、第三次提取和第四次提取；每次提取操作具体包括以下步骤：通过物料转移机构更换过滤件和/或收集件；通过物料转移机构转移上一次滤液至过滤件；通过物料转移机构添加反应试剂；通过物料转移机构转移物料承载介质至加压过滤区；通过压力组件对物料承载介质内部加压使样本过滤分离。

12、通过采用上述技术方案，系统通过控制物料转移机构代替人工操作，减少重复操作带来的人为误差；物料转移机构实现更换物料承载介质、添加不同试剂、推送物料承载介质加压过滤，所有操作整合在一个仪器中有条不紊的进行。

13、可选的，所述步骤s2和步骤s3中使用的物料转移机构包括介质夹取组件和取样组件，所述介质夹取组件用于转移物料承载介质，所述取样组件用于转移样本；所述取样组件装卸有移液tip头，每次转移不同的液体前需要更换不同的移液tip头。

14、通过采用上述技术方案，物料转移机构由介质夹取组件和取样组件组成，通过系统控制介质夹取组件和取样组件独立作业，使整个提取过程更加顺畅；其中取样组件可拆卸连接有移液tip头，可以实现在转移不同液体时，保证提取过程的卫生，降低了交叉感染风险，从而提升样本提取结果准确性。

15、可选的，所述样本放置在物料准备区前，需要对样本信息进行采集处理，所述全自动提取仪的数控系统获取样本的数据来源，用于后续样本数据进行归集处理。

16、通过采用上述技术方案，在处理样本前，通过对样本的基本信息进行采集处理，可以定性每个样本的来源，便于后续每个提取步骤可以进行相应微调整，提高样本的提取适应性；对样本进行标记有利于后续数据的采集对应，减少数据校对成本，进一步提升自动提取仪提取样本外泌体的智能化。

17、可选的，在进行步骤s2之前还包括样本液位检测步骤，通过液位自动检测机构对样本的液位进行检测并将数据采集反馈至全自动提取仪的数控系统。

18、自动提取仪采样时是依据预设的容量参数和行程参数指令进行，以保证每个样本的取样量一致性，样本初始量不一致则意味着液位高度不一致，若不及时调整物料转移机构的行程参数，会导致采样量不足；通过采用上述技术方案，在采样前对样本液位数据进行检测采集，数据系统自适应调整行程参数，从而实现采样的一致性。

19、可选的，在所述加压过滤步骤中，还包括对所述加压组件进行消毒处理步骤。

20、样本过滤提取过程中，需要进行充气加压操作，难免会导致一些样本飞溅到加压组件上，长期以往会滋生细菌而污染样本，进而影响外泌体的提取质量。通过采用上述技术方案，每次在过滤分离前后对加压组件进行消毒处理，从而降低对后续样本的污染。

21、可选的，所述加样区包括第一取样区和第二取样区，在所述步骤s2和步骤s3中，物料转移机构能够使物料承载介质在第一取样区和第二取样区之间切换。

22、由于提取过程中需要更换物料承载介质，通过采用上述技术方案，加样区包括第一取样区和第二取样区，可提供一个行程空间保证不同的物料承载介质更换操作的合理性和顺畅性。

23、可选的，所述第一取样区和加压过滤区设置在同一个滑台上，在过滤分离步骤前后滑台供物料承载介质在第一取样区和加压过滤区之间切换。

24、通过上述技术方案，第一取样区和加压过滤区设置在一个滑台上，因此可以控制物料承载介质在滑台上滑移切换，减少物料转移装置的行程设置，提升操作便利性的同时降低自动提取仪设计的复杂性。

25、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

26、1、样本外泌体的提取全流程通过全自动提取仪完成，提升提取效率的同时降低人为误差，进而提升提取效果的一致性。

27、2、通过具有多孔穴的过滤件与收集件集成，实现批量样本同步提取，降低交叉污染，同时进一步提升提取效率。