多功能真菌防御素修饰肽、其制备方法及应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种多功能真菌防御素修饰肽、其制备方法及应用。
背景技术：
：：1、皮肤作为人体对外界的最大的器官和物理屏障，人体皮肤在温度调节和保护、感知、排泄、吸收、新陈代谢和免疫方面都具有至关重要的作用。因此，皮肤的结构完整性对于维持其正常的生理功能至关重要。然而，许多损伤，包括机械、热、化学、辐射、微生物感染等，可以导致皮肤损伤、组织损失以及结构和功能损伤。皮损发生后机体通常会发生一系列高度复杂的生理过程，诸如止血、炎症调控、增值和重塑等，从而完成伤口的修复(表1)。2、表1伤口愈合的四个阶段3、4、各种类型的细胞(成纤维细胞、巨噬细胞、血小板和上皮角质形成细胞等)和各种活性物质(炎症因子、生长因子、转化因子等)均可调节皮肤修复的过程。尽管皮肤修复是一个与生俱来的正常过程，但是很多因素都可影响愈合，这些影响因素主要可以分为局部因素和系统因素(表2)。5、表2影响伤口愈合的因素6、7、8、对于局部因素而言，氧供和感染是主要的因素：1.增加供氧可以：加速代谢，预防感染，诱导血管生成，增加角质形成细胞分化、迁移和再上皮化，增强成纤维细胞增殖以及胶原蛋白合成，并促进伤口收缩。2.感染：细菌和内毒素均可导致促炎细胞因子如白细胞介素1(il-1)和tnf-α的长期升高，并延长炎症期。长时间的炎症导致基质水平升高金属蛋白酶(mmp)。9、对于系统因素而言，年龄和性别、性激素水平、压力、药物、糖尿病、肥胖、营养是主要的影响因素：1.年龄：随着年龄的增加炎症反应会发生改变，例如延迟t细胞浸润到伤口区域、趋化因子表达的改变和巨噬细胞吞噬能力的降低、胶原合成和血管生成变慢。2.性激素：雌激素通过调节多种与伤口愈合相关的基因来影响伤口愈合，如再生、基质产生、蛋白酶抑制、表皮功能和基因与炎症相关基因。3.药物：干扰凝血或血小板功能或炎症反应和细胞增殖具有影响伤口愈合的能力，糖皮质激素类固醇、非甾体抗炎药和化疗药物也可减缓伤口愈合。4.精神压力：过大的压力会导致伤口愈合缓慢。5.肥胖：肥胖是许多疾病和健康状况的风险因素，包括心血管疾病、糖尿病、癌症、呼吸系统问题，同样肥胖也能够导致伤口愈合变慢。6.营养：例如葡萄糖是组织形成和血管生成所必需的atp的主要来源；蛋白质是成纤维细胞增值、蛋白多糖合成、胶原蛋白合成的基础；脂质能促进炎症相关细胞因子的生成、基因的表达以及伤口部位血管的形成。10、目前临床上最常用的药物主要包括小分子化合物和生长因子。然而，这些单一类型的药物存在一些局限性：例如，小分子药物因合成收率底而导致生产成本高、或者活性不理想；生长因子类药物需要严格的保存条件，在运输、保存和使用过程中容易失活，且运物流成本增加，更重要的是会使伤口过度修复，从而导致增生性瘢痕。在临床实践中，皮肤创面修复与再生仍面临巨大挑战。因此，发现新型分子并研发成具有良好伤口愈合效果和低生产、运输成本药物的是解决上述问题的有效手段。技术实现思路1、为了弥补现有技术的缺点与不足，克服现有促伤口愈合药物的疗效不明显，生产、运输成本高等问题。2、首先，本发明提供了一种化学合成的具有抗菌、抗炎及促进伤口修复功能的真菌防御素修饰多肽、其制备方法及应用。用固相合成技术制备线性多肽中间体后，在通过分子内的二硫键的配对，形成分子内的二硫键，使其空间结构由无规则的线性分子向具有半管氨酸稳定的α/β结构模体(cysteine stable-α/β,csαβ)的转变。最后经过反向高效液相色谱纯化后，获得最终产物——真菌防御素修饰多肽。3、其次，本发明同时提供了该具有抗菌、抗炎及促进伤口修复的真菌防御素修饰肽的制备方法，所提供的制备方法所使用的技术路线易于操作，制备工艺稳定性较强，合成的过程中质量通过质谱检测，使其质量易于控制。能够满足大规模制备及后续工业化量产的需要。4、再次，本发明的另一目的在于提供上述具有抗菌、抗炎和促进伤口修复的真菌防御素修饰肽的应用。本发明所涉及的修饰肽在浓度为μm水平时具有抗革兰氏阳性菌的活性，对于金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)以及临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcus aureus,mrsa)均具有较好的抑制作用。同时能够抑制脂多糖(lipopolysaccharide，lps)刺激后小鼠单核巨噬细胞系raw264.7中促炎细胞因子il-1β和tnf-α的表达。另外，该修饰肽亦能促进成纤维细胞系nih-3t3的迁移，对于小鼠感染伤口，具有促进愈合的作用。5、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：6、1、第一方面，本发明提供一种多功能真菌防御素修饰肽，其特征在于：所述修饰肽的氨基酸序列如seq id no.1所示7、(siccinlpgysglcceahcrkigkpggsctpqnictcnrrrrrr)；8、通过首先制备线性修饰肽，然后通过序列中的8个半胱氨酸残基形成分子内的四对二硫键，形成环状结构，即环状修饰肽；所述环状修饰肽共由44个氨基酸残基组成，理论分子量为4874.75，理论等电点9.54，为强碱性阳离子肽。9、作为优选方案，所述环状修饰肽，其分子内的四对二硫键配对方式为：10、11、更具体地，如图9所示：12、13、第二方面，本发明提供一种制备如上述的多功能真菌防御素修饰肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：14、首先：通过fmoc固相多肽合成技术制备的氨基酸序列为线性序列，如seq id no.1所示(siccinlpgysglcceahcrkigkpggsctpqnictcnrrrrrr)；15、其次：在离子型缓冲液介质tris-hcl中，将分子内半胱氨酸残基侧链的巯基，通过分子内二硫键配对，进而形成环状结构，即即环状修饰肽；16、最后：通过rp-hplc纯化及质谱鉴定获得终产物。17、第三方面，本发明提供一种如上所述的真菌防御素修饰肽在制备抗菌和/或抗炎和/或促进伤口修复药物中的应用。18、作为优选方案之一，所述细菌为革兰氏阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。19、作为优选方案之二，所述真菌防御素修饰肽通过抑制脂多糖诱导的鼠源巨噬细胞系raw264.7中促炎细胞因子il-1β和tnf-α的表达，从而发挥抗炎作用。20、作为优选方案之三，所述真菌防御素修饰肽通过促进鼠源成纤维细胞系nih-3t3的迁移，从而促进伤口愈合。21、第四方面，本发明提供一种药物组合物，其特征在于：包含如上所述的具有抗菌、抗炎、促进伤口修复作用的真菌防御素修饰肽；还包含如权利要求1所述的具有抗菌、抗炎、促进伤口修复作用的真菌防御素修饰肽药学上可接受的盐和/或可接受的辅料。22、作为优选方案，所述辅料包括水溶性填充剂、ph调节剂、稳定剂和渗透压调节剂。23、进一步地，所述药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或凝胶剂中任一种。24、因此，与现有技术相比，本发明的多功能的真菌防御素修饰肽对于伤口愈合，特别是感染性伤口的抗感染治疗及伤口修复具有独特的优势。25、本发明所涉及的真菌防御素修饰肽的模板来源于丝状真菌淡紫拟青purpureocillium lilacinum表达的由147个氨基酸残基组成的蛋白purlisin：序列如下：26、mrfvlaalasaslasalcmpsltceelspaadkacngvcirqgnpkggrclpkdgcpganicacyprkrsldpvqraeyedgdavlrrdleatldagreltdnvtlvkrsiccinlpgysglcceahcrkigkpggsctpqnictcn(seq id no.2)27、翻译后，经过加工，全长多肽可被蛋白酶切割成下划线标注出的肽段，该肽段由38个氨基酸残基组成，在肽段羧基端(碳端)链接6个精氨酸残基，成为六聚精氨酸修饰的肽。最后通过8个半胱氨酸分子形成分子内的四对二硫键，如图10所示。28、经反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquidchromatography,rp-hplc)分离纯化可获得该拟肽分子，固相合成制备的线性修饰肽的理论分子量为4882.75，等电点pi为9.54。形成分子内四对二硫键时，因氧化作用脱去8个氢原子，因此，本发明所设计的真菌防御素修饰肽的活性构象的分子量为：4882.75-8＝4874.75da。29、本发明所涉及的含有四对分子内二硫键的多功能真菌防御素修饰肽的分子式为c196h327n73o57s8，同源模建出的三维空间结构如图9所示。30、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：31、1、本发明提供一种真菌防御素修饰肽，其具有开发成药物的价值；32、2、本发明提供上述真菌防御素修饰肽的制备方法，其原料选择合理且容易获得，制备工艺简单，易于产业化；33、3、该真菌防御素修饰肽具有抗菌、抗炎、促进细胞迁移多重药理学活性，为多功能分子；34、4、该真菌防御素修饰肽具有较低的溶血活性，呈现出较好的安全性。35、综上所述，本发明所涉及的真菌防御素修饰肽可为开发新型具有抗菌、抗炎和促进伤口修复的活性物质及其复方制剂提供新的选择。当前第1页12当前第1页12