一种人间充质干细胞分化成脂能力的检测方法与流程

本发明涉及生物，更具体地，本发明涉及一种人间充质干细胞分化成脂能力的检测方法。

背景技术：

1、人间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells,hmscs)是近年来临床研究发展最为迅速的干细胞类型，其独特的生物学功能可归为三大类：多向分化潜能、免疫调控能力和组织再生功能。其中，多向分化潜能是指hmscs在特定体外诱导分化培养条件下，具有向内、中、外胚层不同细胞系列分化的潜能，表现为向骨、软骨、脂肪、肌、神经等细胞分化的能力。

2、hmscs作为治疗性细胞产品需通过质量控制满足包括基本生物学属性、安全性(微生物学安全性和生物学安全性)及生物学有效性在内的综合性质量要求。其中，生物学有效性是指间充质干细胞必须至少具备成脂、成骨、成软骨分化的能力，因此在其质量控制体系中需要对干细胞的上述分化能力进行检测、评价。目前成脂分化能力的评价方法主要为油红o染色法，该方法培养时间为21天，染色后通过图像软件对染色结果进行分析，所需周期长，仅为半定量分析，数据在分析过程中人为误差较大，不能客观反映hmscs的分化成脂能力。而近年来发展的通过检测细胞内成脂相关因子的mrna水平反映细胞分化成脂能力的相关研究，多为应用qrt-pcr技术检测成脂转录调控因子pparγ和c/ebpβ的表达，缺少成脂标志蛋白的检测，且检测时间长，数据不稳定，无法准确反映细胞的分化能力。因此，亟需开发一种可快速、规范、准确检测人间充质干细胞分化成脂能力的方法，以快速准确的评价细胞分化成脂的能力。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明的目的在于提供一种快速精确的定量检测方法，高效、客观、准确的检测hmscs的成脂分化能力，以解决传统方法存在的检测周期长，数据无法定量等问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一方面，本发明提供一种人间充质干细胞分化成脂能力的检测方法，包括以下步骤：

4、(1)铺板：当干细胞培养瓶内的细胞融合率达到75-85％时，消化，离心，弃去上清液，加入适量培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度，铺板；

5、(2)诱导：铺板后，当细胞融合度到90％以上时，更换诱导培养基，连续培养，取不同诱导时间点的诱导样品，低温保存；

6、其中所述诱导培养基为dmem/f12basic培养基中加入fbs、双抗、l-谷氨酰胺、地塞米松、ibmx、吲哚美辛、罗格列酮、胰岛素；

7、(3)检测：提取样品rna，并逆转录为cdna，以逆转录的cdna为模板，使用实时荧光定量pcr对目标基因和内参基因进行扩增检测；

8、(4)数据处理：同时测定样品中目标基因和内参基因的ct值，计算样品的目标基因相较空白样品的目标基因的相对表达倍数。

9、优选地，步骤(1)中铺板细胞密度为1×105cells/cm2。

10、优选地，步骤(1)中铺板所使用的为明胶包被板。

11、优选地，步骤(2)中所述诱导培养基中各添加成分的浓度分别为fbs10％(v/v)，双抗1％(v/v)，l-谷氨酰胺1％(v/v)，地塞米松1μm，ibmx450μm，吲哚美辛100μm，罗格列酮2μm，胰岛素12μg/ml。

12、优选地，步骤(2)中诱导时间为7天和14天。

13、优选地，步骤(3)中所述检测的目标基因为：ppar-γ，lpl，adipoq，fabp4，内参基因为gapdh。以ppar-γ，lpl，adipoq，fabp4，gapdh为靶基因设计的pcr检测引物核苷酸序列如表1所示。

14、表1.引物组的具体信息

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17、另一方面，本发明提供上述检测方法在干细胞质量控制中的应用。

18、与现有技术相比，本发明所使用的诱导体系、诱导方法可有效缩短诱导时间，检测周期更短，测定时使用的标志物和检测序列具有较高的特异性和灵敏度。本发明提供的整套检测方法可实现快速精确的定量检测，操作简便，检测周期短，灵敏度高，适用范围广，可用于不同来源、不同批次、不同代次干细胞的分化成脂能力的检测、评价，可作为标准化方法用于干细胞质量控制。

技术特征：

1.一种人间充质干细胞分化成脂能力的检测方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中铺板细胞密度为1×105cells/cm2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中铺板所使用的为明胶包被板。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述诱导培养基中各添加成分的浓度分别为fbs10％(v/v)，双抗1％(v/v)，l-谷氨酰胺1％(v/v)，地塞米松1μm，ibmx450μm，吲哚美辛100μm，罗格列酮2μm，胰岛素12μg/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中诱导时间为7天和14天。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述检测的目标基因为：ppar-γ，lpl，adipoq，fabp4，内参基因为gapdh。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中以ppar-γ，lpl，adipoq，fabp4，gapdh为靶基因设计的pcr检测引物核苷酸序列如下所示：

8.权利要求1-7任一项所述的方法在干细胞质量控制中的应用。

技术总结
本发明提供了一种人间充质干细胞分化成脂能力的检测方法，通过诱导成脂培养基培养后，应用实时荧光定量PCR方法检测细胞内成脂转录因子及成脂标志蛋白的mRNA水平，实现对细胞分化成脂能力的定量评价。本发明的方法可实现快速精确的定量检测，检测周期短，灵敏度高，适用范围广，可用于不同来源、不同批次、不同代次干细胞的分化成脂能力的检测、评价，可作为标准化方法用于干细胞质量控制。

技术研发人员：慈小燕,闫凤英,丁凯,娄云云
受保护的技术使用者：天津和创生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1