编码冠状病毒抗原的重组DNA分子、DNA疫苗及应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及编码冠状病毒抗原的dna分子、dna疫苗及应用。

背景技术：

1、冠状病毒属于冠状病毒科(coronaviridae)，包括α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒四个属，现阶段流行的新型冠状病毒(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2,sars-cov-2)属于β属的冠状病毒，主要经呼吸道飞沫传播，也可通过接触传播引起肺炎(novel coronavirus-infected pneumonia，ncp),人群普遍易感。

2、目前世界卫生组织在新冠病毒突变株的分级中，主要分为两类，一类是令人担忧的突变株(voc),另一类是值得关注的突变株(voi)。截止到目前已有的5个voc突变株，分别为阿尔法(alpha，编号b.1.1.7)、贝塔(beta，编号b.1.351)、伽马(gamma，编号p.1)、德尔塔(delta，编号b.1.617.2)以及奥密克戎(omicron，编号b.1.1.529)变异株；8个voi突变株分别为伊普西龙(epsilon，编号b.1.427/429)、泽塔(zeta，编号p.2)、西塔(theta，编号p.3)、艾塔(eta，编号b.1.525)、约塔(iota，编号b.1.526)、卡帕(kappa，编号b.1.617.1)、拉姆达(lambda，编号c.37)以及缪(mu，编号b.1.621)。尤其是近期爆发的奥密克戎变异株由于在主要保护性抗原spike区段发生了30余处突变，在受体结合域(rbd)有15个突变位点，其中11个在受体结合基序(rbm)区域，包括之前在贝塔以及伽马突变株中出现的三处突变：417，484以及501，其中n501y在阿尔法突变株中也存在。目前的研究发现，大部分rbd抗体结合在rbm区域，在rbm区域发生突变时，结合在这些区域的抗体很容易受到影响而发生逃逸。值得一提的是，另外4个不在rbm区域的突变位点分布在s单体的相互作用界面，可能会影响三聚体的稳定性。另外，15个突变中，9个位点在sars-cov-2s与sars-cov s之间不保守，突变还是大部分发生在不保守区。同时氨基末端域(ntd)的突变位点集中在四处：a67v/del69-70；t95i；g142d/del143-145；del211/l212i，这四处在结构上集中在ntd表面，也是新冠ntd抗体常见的识别位点；因此这些位点同时突变，也会影响ntd抗体的亲和力和中和活性。基于现有对突变位点的了解，该变异株突破了大部分中和抗体的保护，部分前期数据表明该变异株使得新冠疫苗的中和抗体比野生型降低了约40倍，基于各种频出的变异株以及超级传播力的奥密克戎的出现，开发“以不变应万变”的广谱疫苗是应对变异株频出的有效手段。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种编码sars-cov-2病毒抗原的重组核酸分子，期望能够实现“以不变应万变”的广谱免疫效果。

2、本发明的目的之二在于提供包括上述重组核酸分子的生物材料。

3、本发明的目的之三在于提供上述生物材料的应用。

4、本发明的目的之四在于提供包括上述重组核酸分子和/或生物材料的sars-cov-2病毒的dna疫苗。

5、本发明的目的之五在于提供上述dna疫苗的制备方法。

6、为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

7、第一方面，本发明提供重组核酸分子，所述重组核酸分子包括如下(a)～(c)任一种：

8、(a)重组dna分子包括，编码新冠sars-cov-2beta突变株s蛋白rbd区的第一dna分子和编码新冠sars-cov-2 omicron突变株s蛋白rbd区的第二dna分子；

9、(b)在(a)限定的重组dna分子的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有编码新冠sars-cov-2beta突变株s蛋白rbd区和编码新冠sars-cov-2omicron突变株s蛋白rbd区功能的由(a)衍生的dna分子；

10、(c)在严格条件下与(a)限定的重组dna分子或(b)限定的dna分子的核苷酸序列杂交，且编码新冠sars-cov-2beta突变株s蛋白rbd区和新冠sars-cov-2 omicron突变株s蛋白rbd区的核酸分子。

11、在可选的实施方式中，所述第一dna分子编码的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述第二dna分子编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

12、在可选的实施方式中，所述第一核酸分子的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述第二核酸分子的核苷酸序列如seq id no.4所示。

13、优选地，所述重组核酸分子的核苷酸序列如seq id no.5所示，或者与seq idno.5所示的核苷酸序列具有至少90％一致性，且编码新冠sars-cov-2beta突变株s蛋白rbd区和新冠sars-cov-2 omicron突变株s蛋白rbd区的核苷酸序列。

14、第二方面，本发明提供生物材料，包括：

15、(ⅰ)构建体，包括前述实施方式任一项所述的重组核酸分子；和，连接于重组核酸分子5’端的编码信号肽的第三核酸分子；

16、(ⅱ)重组表达载体，包括原始表达载体；和，插入原始表达载体的编码核酸片段，所述编码核酸片段选自前述实施方式任一项所述的重组核酸分子或所述(ⅰ)构建体；优选地，所述原始表达载体为pvax1质粒；

17、(ⅲ)将所述(ⅱ)重组表达载体导入宿主细胞获得的转化体，所述宿主细胞选自昆虫细胞、酵母、禽类细胞或哺乳动物细胞；优选地，所述宿主细胞为hek293、cho或cos-7；

18、(ⅳ)多肽，包括前述实施方式任一项所述重组核酸分子编码的多肽、所述(ⅰ)构建体编码的多肽，或者，(ⅲ)转化体表达获得的多肽；

19、(ⅴ)与所述(ⅳ)多肽特异性结合的抗体。

20、在可选的实施方式中，所述第三核酸分子编码的信号肽包括如下(c)或(d)：

21、(c)氨基酸序列如seq id no.6所示的信号肽；

22、(d)在(c)限定的信号肽的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有信号肽功能的由(c)衍生的信号肽。

23、第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述重组核酸分子或前述实施方式任一项所述生物材料在如下(a)或(b)中的应用：

24、(a)制备预防和/或治疗sars-cov-2病毒感染的疫苗；

25、(b)制备预防和/或治疗sars-cov-2病毒引起的相关疾病的药物。

26、在可选的实施方式中，所述sars-cov-2病毒包括野生株、b.1.617.2突变株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.621突变株、b.1.525突变株、b.1.526突变株、c.37突变株、b.1.617.1突变株或b.1.1.529突变株。

27、第四方面，本发明提供dna疫苗，所述dna疫苗包括前述实施方式任一项所述重组核酸分子或前述实施方式任一项所述的重组表达载体。

28、在可选的实施方式中，所述dna疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种；

29、和/或，至少一种对sars-cov-2病毒有治疗作用的药物；

30、优选地，所述佐剂包括铝佐剂、tlrs配体、金属离子、细胞因子或趋化因子佐剂中至少一种；

31、进一步优选地，所述金属离子包括mn2+和/或zn2+。

32、在可选的实施方式中，将前述实施方式任一项所述重组核酸分子或前述实施方式任一项所述的重组表达载体导入宿主细胞并进行培养，提取宿主细胞中的重组核酸分子或重组表达载体，得到dna疫苗。

33、第五方面，本发明提供了前述实施方式所述dna疫苗的在如下(i)～(iii)中的应用：

34、(i)调整机体的免疫功能；

35、(ii)抗sars-cov-2病毒感染；

36、(iii)防止免疫病理损伤。

37、优选地，所述sars-cov-2病毒包括野生株、b.1.617.2突变株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.621突变株、b.1.525突变株、b.1.526突变株、c.37突变株、b.1.617.1突变株或b.1.1.529突变株。

38、第六方面，本发明提供了一种预防和/或治疗哺乳动物感染sars-cov-2病毒的方法，所述方法包括对所述哺乳动物接种上述dna疫苗。

39、优选的，所述sars-cov-2病毒包括野生株、b.1.617.2突变株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.621突变株、b.1.525突变株、b.1.526突变株、c.37突变株、b.1.617.1突变株或b.1.1.529突变株。

40、优选的，所述哺乳动物为人。

41、本发明将编码新冠sars-cov-2beta突变株s蛋白rbd区的核酸分子与编码新冠sars-cov-2 omicron突变株s蛋白rbd区的核酸分子重组，所述重组核酸分子编码的多肽同时具有新冠sars-cov-2beta突变株s蛋白rbd区和新冠sars-cov-2 omicron突变株s蛋白rbd区的双重免疫原性，以该具有双重免疫原性的多肽作为疫苗免疫效应组分时，诱导合成的中和抗体能够同时针对新冠sars-cov-2beta突变株s蛋白rbd区和新冠sars-cov-2omicron突变株s蛋白rbd区形成免疫反应。同时，采取sars-cov-2突变株的双抗原设计，尽可能地使针对sars-cov-2亲缘内的保守抗原表位得到免疫效果的放大，从而避免sars-cov-2亲缘内的不断突变带来的抗原漂变，从而实现“以不变应万变”的广谱免疫效果。同时，在蛋白结构域串联策略上选择的beta-omicron rbd的串联顺序相较于omicron-betarbd的串联顺序使得beta rbd和omicron rbd两个抗原结构域在空间结构上的β-折叠更规则，更规则的蛋白空间结构会使抗原抗体反应更好，免疫效果更优。

42、基于上述重组核酸分子的有益效果，本发明还提供了上述重组核酸分子得到制备方法，制备上述重组核酸分子所使用的生物材料，以及上述重组核酸分子表达得到的多肽，同时提供了以上述生物材料为主要免疫组分的dna疫苗及其制备方法，经验证，该dna疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达，同样也具有良好的免疫原性，对于体液免疫应答，该dna疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天以及第14天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，不仅可以产生针对新冠野生型抗原的抗体，还能产生针对新冠delta突变株抗原、beta突变株抗原、omicron突变株抗原的抗体，并且具有中和活性；对于细胞免疫应答，针对新冠野生型抗原、新冠delta突变株抗原以及omicron突变株抗原，该dna疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性ifn-γ反应，而且能够诱导抗原特异性cd4ifnγ和cd4 tnf-αt细胞亚群的产生；以上体液免疫和细胞免疫实验均体现了该dna疫苗具有的良好免疫原性和广谱性。

43、基于此，本发明提供的dna疫苗能够调整机体的免疫功能，有效预防sars-cov-2病毒及其突变株感染，同时也能干预治疗由sars-cov-2病毒及其突变株引发的疾病。