1.本发明涉及基因工程和微生物改造技术领域，具体涉及一种毕赤酵母菌株及其在甘露聚糖酶生产中的应用。
背景技术：
2.甘露聚糖是一类非淀粉多聚糖，属于半纤维素，其含量仅次于木聚糖，是植物细胞壁的一种主要成分。其中甘露聚糖主要由甘露糖通过β-1,4糖苷键连接形成主链，侧链由α/β-1,6-糖苷键连接半乳糖、葡萄糖等。根据侧链的不同，甘露聚糖又分为半乳甘露聚糖、线性甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖和葡甘露聚糖。
3.甘露聚糖占饲料中非淀粉多糖的30%，是目前大量应用的玉米豆粕型饲料中主要的抗营养因子。它们能结合大量的水分，使采食动物消化道中食糜的体积增大、黏度增加、养分与消化道内源酶的作用降低、营养物质的消化率下降，造成动物生长受阻、饲料转化率降低，从而使其代谢受到抑制。
4.水解甘露聚糖的关键酶是β-甘露聚糖酶，其主要水解主链的β-1,4-d-吡喃甘露糖苷键。在饲料中添加甘露聚糖酶能有效消除它们的抗营养作用，提高动物的生产性能。另外，添加β-甘露聚糖酶后，在动物体内能够产生甘露寡糖，可进一步刺激和增强动物的免疫反应，调控动物胃肠道微生态环境，促进有益菌生长，抑制有害菌黏附。现己证实β-甘露聚糖酶对动物的生长发育也具有一系列积极作用。另外甘露聚糖酶可广泛应用于纺织、造纸、饲料、食品、医药以及石油等领域。
5.甘露聚糖酶广泛存在于自然界中的动物、植物、微生物中，但主要来源于细菌、真菌等微生物。己报道的产甘露聚糖酶的微生物有芽孢杆菌、酵母、青霉、曲霉、木霉、假单孢菌和链霉菌等。目前在理论研究和工业化生产中均得到了较为广泛的应用。由于产β-甘露聚糖酶生物的种类、生活环境、生存方式等方面有所不同，不同来源的β-甘露聚糖酶在理化性质上也有较大差别，如酶的存在形式、相对分子量、等电点、酶反应动力学特性及底物专一性等都有较大的差异。目前，国内外对来源不同菌种的β-甘露聚糖酶的研究、生产和应用多集中在碱性和中性酶方面，而在饲料中应用的甘露聚糖酶，需要在酸性条件下具有较高活性，因此，酸性β-甘露聚糖酶的研究与开发在饲料工业应用中有重要意义。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供一种高产甘露聚糖酶的毕赤酵母菌株。申请人首先将来源于棒曲霉（aspergillus clavatus）的甘露聚糖酶基因在毕赤酵母宿主中过表达，然后进一步通过紫外诱变方法筛选获得甘露聚糖酶产量显著提高的突变菌，从而降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。
7.本发明一方面涉及一种重组质粒，其携带有甘露聚糖酶基因。
8.所述甘露聚糖酶基因的核苷酸序列为seq id no：1，编码的氨基酸序列为seq id no：2。
9.本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有上述重组质粒。
10.本发明还涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
11.所述突变菌株为毕赤酵母bg-18（pichia pastoris bg-18），已于2022年7月20日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20221137。
12.本发明还涉及所述毕赤酵母突变菌在甘露聚糖酶生产中的应用。
13.有益效果本发明通过紫外诱变筛选获得的突变菌株毕赤酵母bg-18，能大幅度提高甘露聚糖酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中甘露聚糖酶酶活高达53610u/ml，较出发菌株提高了44.8％，取得了意料不到的技术效果。
14.所述突变菌株可作为甘露聚糖酶的发酵生产菌株，有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的广泛应用。
具体实施方式
15.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
16.菌株与载体：大肠杆菌dh5α本公司保藏，毕赤酵母gs115、表达载体ppic9k、抗生素amp、g418、zeocin购自invitrogen公司。
17.酶与试剂盒：dna聚合酶购买自takara公司，t4连接酶、限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorph ii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
18.培养基配方：大肠杆菌培养基（lb培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；lb-氨苄青霉素培养基：lb培养基加100μg/ml amp；酵母培养基（ypd培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；酵母筛选培养基（md培养基）：1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，1%甘油，2%琼脂糖；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，0.5%甲醇。
19.下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。
20.实施例1、甘露聚糖酶基因bg的克隆申请人根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于棒曲霉（rhizomucor miehei）的甘露聚糖酶基因bg进行密码子优化，获得优化后的核苷酸序列seq id no:1，其编码的氨基酸序
列为seqidno:2。
21.以合成的核苷酸序列为模板，设计引物，扩增出甘露聚糖酶基因片段。引物引物1(f)和引物1(r)的序列如下：引物1(f)：gcgcgaattcgcgcccggcaagccccacggcaagc（下划线处为ecori的酶切位点）；引物1(r)：taaagcggccgctcaaacccatccctgcttggccttg（下划线处为noti的酶切位点）。
22.pcr反应条件为：94℃变性5min；然后98℃变性10s，56℃复性15s，72℃延伸1min20s，35个循环后，72℃保温10min。bg基因全长1029bp。
23.实施例2、毕赤酵母工程菌的构建1、重组质粒的构建将克隆得到的甘露聚糖酶基因bg和表达载体ppic9k用限制性内切酶ecori和noti进行双酶切，100μl酶切体系如下：基因bg/ppic9k：40μl；10
×
fastdigestbuffer：10μl；ecori：2μl；noti：2μl；ddh2o：46μl；37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
24.将经ecori和noti双酶切的bg片段与表达载体ppic9k连接，构建表达载体ppic9k-bg。连接体系如下：表达载体ppic9k双酶切产物5μl、bg基因双酶切产物3μl、10
×
t4ligasebuffer1μl、t4ligase1μl。22℃连接过夜，转化到大肠杆菌dh5α，挑取转化子送由华大基因进行测序验证。测序验证正确的转化子转接到lb+amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒ppic9k-bg。
25.2、转化与筛选将重组酵母表达质粒ppic9k-bg用sali进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电转化方法转化毕赤酵母gs115，涂布md平板。在md平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后分别接种于含0.25，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0mg/ml遗传霉素g418的ypd平板上筛选多拷贝的转化子。
26.3、摇瓶发酵和酶活力检测挑取单个多拷贝转化子分别接入bmgy培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入bmmy培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24h添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行甘露聚糖酶酶活力测定。
27.结果显示，在摇瓶条件下，本发明构建得到的毕赤酵母工程菌发酵上清液中甘露聚糖酶酶活最高达到2984u/ml，将该转化子命名为毕赤酵母bg（pichiapastorisbg）。
28.甘露聚糖酶酶活检测方法(1)甘露聚糖酶酶活单位的定义在37℃、ph值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。
29.(2)酶活测定方法(2.1)标准曲线的绘制：吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液4.0ml，加入dns试剂5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。
30.分别吸取甘露糖溶液(5.5)1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100ml，配制成浓度为0.10-0.70mg/ml d-甘露糖标准溶液。
31.分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml(做二个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液和5ml dns试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度od值。
32.以甘露糖浓度为y轴、吸光度od值为x轴，绘制标准曲线。每次新配制dns试剂均需要重新绘制标准曲线。
33.(2.2)酶活力测定：以0.6%槐豆胶甘露聚糖（sigma公司, g0753）为底物，以0.1m 乙酸-乙酸钠（ph5.5）为缓冲液，将甘露聚糖底物37℃平衡20min，将待测酶液37℃平衡10min。取4支试管，分别加入酶液2ml，其中3支作为测定管，分别加入2ml 底物溶液，另一支作为空白管，加入5ml dns溶液，在37℃
±
0.5℃水浴30分钟。然后三支测定管分别加入5ml dns溶液，空白管加入2ml 底物溶液，在沸水浴中反应5 min，冷却后定容至25ml。以空白管调零，在分光光度计540nn 处测吸光度。
34.酶活计算公式：。
35.式中：xd为稀释酶液中甘露聚糖酶的活力，u/ml；ae为酶反应液的吸光度；ab为酶空白液的吸光度；k为标准曲线的斜率；c0为标准曲线的截距；m为木糖的摩尔质量，150.2 g/mol；t为酶解反应时间，min；n为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
36.实施例3、甘露聚糖酶高产菌株的诱变筛选紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。
37.申请人以毕赤酵母bg为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其甘露聚糖酶的产量。
38.将毕赤酵母bg接种于ypd平板，30℃培养2-3天，使用无菌水洗菌体两次后，打散细胞制成悬浮液，稀释至1
×
106个/ml，紫外灯（40w）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板，30℃培养48h。
39.第一轮紫外诱变共获得了约300个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul bmgy液体培养基的96孔板，30℃、250rpm振荡培养1天后，离心去掉上层培养基，再加入200ul bmmy培养基，30℃、250rpm振荡培养2天，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2天后，离心去除菌体，得到含甘露聚糖酶的上清液，测定甘露聚糖酶的活力，以出发菌毕赤酵母bg为
对照，筛选出酶活力得到显著提高的突变菌株。
40.结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中甘露聚糖酶酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了17轮诱变筛选，最终获得1株甘露聚糖酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为毕赤酵母bg-18（pichia pastoris bg-18）。
41.所述突变菌株在摇瓶发酵条件下其发酵上清液中甘露聚糖酶酶活力高达4467u/ml，比出发菌提高了49.7%，取得了意料不到的技术效果。
42.实施例4高密度发酵验证发酵过程具体如下：1、种子液制备阶段将出发菌bg和突变菌bg-18分别接种于ypd培养基，30 ℃，200rpm摇床培养约8h，获得种子液。
43.2、发酵前期培养阶段以2％接种量将种子液接入bsm无机盐甘油培养基，接种前使用氨水调节ph至5.5，通气搅拌培养，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低。当碳源消耗完后溶氧量会再度升高，当溶氧升高至80％以上时，开始碳源流加补料发酵阶段。 其中，bsm培养基山以下成分组成:85％h3po
2 6 .7ml/l，caso4·
2h2o 0 .93g/l，k2so
4 18 .2g/l，mgso4·
2h2o 14 .9g/l，koh 4 .13g/l，甘油40g/l，pmt1 4 .0ml/l。所述pmt1配方: cuso4·
5h2o 6 .0g/l，ki 0 .088g/l，mnso4·
h2o 3 .0g/l，na2moo4·
2h2o 0 .2g/l，h3bo
3 0 .02g/l，cocl2·
6h2o 0 .5g/l，zncl
2 20 .0g/l，feso4·
7h2o 65 .0g/l，生物素0 .2g/l，浓硫酸5ml/l(过滤除菌)。
44.3、流加补料发酵阶段流加40％甘油溶液(含12ml/l ptm1)，同时控制溶氧在60％左右，至菌体湿重达 180g/时，停止甘油补料。
45.4、诱导表达阶段流加甲醇(含12ml/l ptm1)诱导产酶，同时调节甲醇补料速度。将溶氧维持在20％左右，检测甘露聚糖酶活力不再升高时即可停止诱导。
46.检测结果显示，上述高密度发酵168h后，出发菌毕赤酵母bg发酵上清液中甘露聚糖酶酶活为37012u/ml，而突变菌毕赤酵母bg-18的酶活达到53610u/ml，较出发菌株提高了44.8％，取得了意料不到的技术效果。
47.申请人已于2022年7月20日将突变菌毕赤酵母bg-18（pichia pastoris bg-18）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20221137。
48.综上，本发明利用紫外诱变技术筛选获得的突变菌毕赤酵母bg-18能大幅提高甘露聚糖酶的产量，有效降低甘露聚糖酶的生产成本。