一种超灵敏核酸突变检测方法、探针及其应用与流程

本发明涉及生物检测，具体涉及一种超灵敏核酸突变检测方法、探针及其应用。

背景技术：

1、检测核酸结构的微小变化对基因组学的研究以及个体化医疗至关重要。尤其是低丰度的单核苷酸的变异(single nucleotide variation，snv)作为癌症分子诊断的生物标志物近年来被广泛关注。目前已经有大量的核酸突变检测技术相继被开发并用于癌症标志物筛查、预后诊断以及指导用药等。这些方法可以被分为两类：实时突变检测法以及扩增后突变检测法。实时突变检测方法主要有qpcr、allele-specific pcr、arms-pcr、以及cast-pcr。这些方法往往依赖于taqman探针或引物的特异性来识别单碱基突变。taqman探针序列较长，识别单碱基突变灵敏度低(>1％)；设计具有高度特异性的引物十分困难，往往需要依赖于经验性设计和大量的实验筛选，耗时耗力。功能性化学修饰的引入提高了突变检测的特异性但增加了成本。一些扩增后检测突变的方法也被开发用于扩增后的双链产物进行突变的检测，它们主要是借助于核酸外切酶、温度或者化学试剂变性、crispr等方法。然而扩增后检测的方法面临着三个挑战：一，突变靶标序列本身易折叠成稳定的二级结构，导致检测信号的损失；二，易受其他核酸靶标的干扰，难以实现多通道突变检测；三，它们的检测窗口较窄，不利于低丰度突变的检测。相同信号可能是低浓度的snv产生的，也可能是高浓度的wt产生的，因此导致窄的检测窗口。

2、因此，需要发展一种新的低丰度基因突变检测方法，能够避免复杂dna自身的二级结构以及其他靶标的干扰，从根本上解决基因突变检测窗口窄，特异性不够等问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种超灵敏核酸突变检测方法、探针及其应用，旨在解决现有突变检测技术中复杂靶标存在严重的自身二级结构，以及易受其他靶标的干扰问题；同时解决现有杂交探针的热力学本质导致突变检测窗口窄的问题。

2、在本发明第一方面，提供一种核酸突变检测方法，其包括如下步骤：

3、(1)将待测dna与组装探针、反应体系混合，加热解旋，然后快速冷却；

4、(2)加入报道探针；

5、(3)检测。

6、其中，待测dna的两条链分别记为a链、b链，待测链为a链。

7、在本发明的一个优选实施方式中，所述核酸突变为单核苷酸变异(snv)。

8、具体地，单核苷酸变异可以为取代(取代为a、t、c、g中的一个)、插入(插入a、t、c、g中的一个)或缺失。

9、具体地，报道探针包括探针f和探针q，其中探针f的部分核苷酸序列与a链的部分序列s1互补，且该序列s1包含待测突变(例如snv)位点ts；

10、探针q的核苷酸序列与探针f的核苷酸序列互补，且探针q的核苷酸序列长度小于探针f的核苷酸序列长度。

11、即，探针f的核苷酸序列可分为f1段和f2段(即探针f由f1段和f2段组成)，其中f1段与a链的部分序列s1互补，f2段(reverse toehold)与a链不互补，但f2段与探针q互补。f2段与a链不互补并不影响探针f与a链的相互作用，而且这种设计有利于更有效地识别突变位点。

12、具体地，探针f的f2段的长度可以为4-8nt(例如4、5、6、7、8nt)，特别是5-6nt。

13、具体地，探针q的序列长度可以为15-40nt(例如15、16、18、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40nt)，特别是20-40nt。

14、具体地，探针f的序列长度与探针q的序列长度可以相差5-15nt(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15nt)，特别是6-8nt。

15、具体地，所述报道探针通过荧光标记；其中，探针f标记有荧光报告基团，探针q标记有荧光淬灭基团，例如，探针f的5’端标记有荧光报告基团，探针q的3’端标记有荧光淬灭基团(探针f从5’端开始与探针q(从3’端开始)互补，且探针f的长度大于探针q的长度)；或探针f的3’端标记有荧光报告基团，探针q的5’端标记有荧光淬灭基团(探针f从3’端开始与探针q(从5’端开始)互补，且探针f的长度大于探针q的长度)。

16、具体地，所述荧光报告基团可以为，例如，fam、texas red、rox、tet、vic、joe、hex、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、lc red640、lc red705等。

17、具体地，所述荧光淬灭基团可以为，例如，iowa black、tamra、dabcyl、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3等。

18、具体地，组装探针包含探针p1，其核苷酸序列与b链的部分序列s1'互补，且该序列s1'包含与a链待测突变(例如snv)位点ts互补的位点；

19、组装探针还包含多条探针pn(例如p2，p3，p4，…)，n为＞2的整数(例如3、4、5、6、7、8、9、10)，探针pn的核苷酸序列与b链的部分序列互补，且探针p1和pn的核苷酸序列均不相同(即不存在探针序列重叠的情况)；

20、优选地，组装探针还包含一条或多条探针pm'(例如p2'，p3'，p4'，…)，m为＞1的整数(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10)，探针pm'与a链的部分序列sm互补，并且探针pm'的核苷酸序列与探针f的核苷酸序列不相同(即探针pm'与探针f不存在序列重叠的情况，暴露出靶标检测窗口)。

21、具体地，探针p1和所有探针pn(例如p2，p3，p4，…)的序列组合与a链的完整序列相同(即p1+p2+p3+p4+…＝a链)。

22、具体地，探针pm'中的一条或多条可以与探针pn中的一条或多条互补，且相互补的探针序列长度不同。

23、具体地，组装探针的序列长度可以为12-40nt(例如15、16、18、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40nt)。

24、具体地，相互补的探针序列长度不同，可以相差5-15nt(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15nt)，特别是5-8nt。

25、具体地，所有探针pm'(例如p2'，p3'，p4'，…)与探针f的序列组合长度小于等于b链的完整序列长度；在本发明的一个实施例中，一条或多条探针pm'(例如p2'，p3'，p4'，…)与探针f的序列组合为b链的完整序列。

26、在本发明的一些实施例中，n为3、4或5。

27、在本发明的一些实施例中，m为2、3或4。

28、在本发明的一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4。

29、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'，其中，p2'与p2、p3、p4均不互补。

30、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同。

31、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'、p3'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同，p3'与p2、p3、p4均不互补。

32、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'、p3'、p4'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同，p3'与p3互补且p3'的序列长度与p3不同，p4'与p4互补且p4'的序列长度与p4不同。

33、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4、p5，以及p2'、p3'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同，p3'与p3互补且p3'的序列长度与p3不同。

34、具体地，序列s1'与序列s1部分互补(序列s1'与s1不完全互补)。

35、具体地，待测dna与组装探针的摩尔比可以为1000:1-1000(例如1000:1、500:1、250:1、125:1、1:1、1:125、1:250、1:500、1:1000)。

36、具体地，待测dna与报道探针的摩尔比可以为1:0.1-100(例如1:0.1、1:0.5、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100)。

37、具体地，步骤(1)中所述混合体系中待测dna的浓度可以为1am至1μm(例如1am、1fm、1pm、500pm、1nm、5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、80nm、100nm、200nm、400nm、500nm、600nm、800nm、1000nm)，特别是1-1000nm。

38、具体地，步骤(1)中所述反应体系包含缓冲液，例如tris缓冲液，可用于溶解dna，稳定储存dna。

39、具体地，步骤(1)中所述反应体系还包含螯合剂，例如edta，可抑制dna酶的活性，防止dna被酶降解。

40、具体地，步骤(1)中所述反应体系还包含核苷酸保护剂，如tween 20，用于防止稀释和移液等过程中dna寡核苷酸的潜在损失；其中，核苷酸保护剂的含量可以为0.1％-1％(v/v)。

41、在本发明的一个实施方式中，所述反应体系为te缓冲液，其中含有0.5％吐温20。

42、具体地，步骤(1)中所述加热解旋温度为80-99℃(具体如80、82、84、86、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99℃)；在本发明的一个实施例中，该温度为95℃。

43、具体地，步骤(1)中所述加热时间为1-10分钟(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟)；在本发明的一个实施例中，该时间为5分钟。

44、具体地，步骤(1)中所述快速冷却可以为在1-5分钟内(例如1、2、3、4或5分钟内)冷却至0-5℃(例如0、1、2、3、4、5℃)；在本发明的一个实施例中，所述快速冷却为在2分钟内冷却至4℃。

45、具体地，步骤(3)中所述检测在加入报道探针后2小时内(例如2小时内，1小时内，30分钟内，15分钟内，5分钟内)进行。

46、具体地，步骤(3)中所述检测为检测步骤(2)所得混合物的荧光数据。

47、具体地，步骤(3)中所述检测在37℃的温度下进行。

48、在本发明的一个实施方式中，所述方法还可以包括将待测dna通过核酸扩增技术(如聚合酶链式反应(pcr))进行扩增的步骤。

49、在本发明的一个优选实施方式中，所述方法还可以包括将待测dna通过抑制链置换扩增(bda)(仅需要在pcr步骤引入一条抑制链即可实现数量级的突变富集)进行扩增的步骤。

50、在本发明的一个实施方式中，所述方法还可以包括(例如从组织、血液、细胞样本或其他样本中)提取待测dna的步骤。

51、具体地，所述方法还包括对标准品(序列与无突变的待测dna相同，也称为野生型(wt)，可通过人工合成)进行检测的步骤(与待测dna相同的检测步骤)。

52、具体地，所述检测可以为定性检测，也可以为定量检测。

53、在本发明的一个实施方式中，所述检测为定性检测，可通过将待测dna样品与等量的标准品的检测信号(例如荧光信号)强弱对比进行。

54、在本发明的一个实施方式中，所述检测为定量检测，可以通过测得的待测dna样品的检测信号(例如荧光信号)，利用标准曲线，计算出待测dna样品中无变异dna的量，进而得到该样品中变异dna的量。

55、具体地，所述方法还包括建立标准曲线的步骤，例如，利用标准品的量与相应的标准品的检测信号(例如荧光信号)建立标准曲线。

56、具体地，所述方法适用于不同长度范围的靶标，上述待测dna的长度可以为，例如，10-500bp，特别是80-200bp。

57、具体地，所述方法可同时检测同一待测dna中一个或多个单核苷酸变异位点，也可以同时检测多个不同待测dna，此时针对不同snv的报道探针可采用不同的互不干扰的荧光标记，实现多通道的信号读出。

58、在本发明的一个优选实施方式中，所述核酸突变为肿瘤相关的基因突变，其中突变基因例如mendiratta g,ke e,aziz m,liarakos d,tong m,stites ec.cancer genemutation frequencies for the u.s.population.nat commun.2021oct 13；12(1):5961.中所述，如tp53、pik3ca、lrp1b、kras、apc、fat4、kmt2d、kmt2c、braf、arid1a、fat1、pten、atm、zfhx3、crebbp、grin2a、nf1、pde4dip、ptprt、trrap、rnf213、prex2、spen、erbb4、kmt2a、rb1、brca2、fbxw7、card11、ptprb、ros1、atrx、ubr5、notch1、polq、ep300、ncor1、setd2、smarca4、chd4、mtor、ncor2、med12、ranbp2、arid2、znf521、setbp1、pole、ctnnb1、egfr。

59、在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸突变为egfr突变，例如egfr外显子21点突变(l858r突变)、egfr外显子19缺失突变(19del突变)、egfr外显子20点突变(t790m突变)、egfr外显子20插入突变(egfr ex20in)、egfr外显子18点突变(g719x突变)、egfr外显子21点突变(l861q突变)、egfr外显子20点突变(s768i突变)等。

60、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr l858r突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.28所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.29所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.14、15、20、21、22所示。

61、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr 19del突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.16、17、23、24。

62、在本发明另一些实施例中，所述核酸突变为egfr 19del突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.34、17、23、24所示。

63、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr t790m突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.32所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.18、19、25-27所示。

64、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr l858r突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.44-48所示。

65、在本发明另一些实施例中，所述核酸突变为egfr 19del突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.49-52所示。

66、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr t790m突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.32所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.53-56所示。

67、在本发明的一些实施例中，所述检测为多重检测(同时检测同一待测dna中一个或多个单核苷酸变异位点，或同时检测多个不同待测dna)，可以将不同针对不同靶标的探针组合同时进行检测，例如所述核酸突变为egfr l858r突变、egfr 19del突变和egfr t790m突变，所述报道探针f的核苷酸序列分别如seq id no.28、30、32所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.29、31、33所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.14、15、20、21、22、34、17、23、24、18、19、25-27所示(如本发明实施例3所示)(此时针对不同snv的报道探针可采用不同的互不干扰的荧光标记，实现多通道的信号读出)。

68、在本发明第二方面，提供一种用于核酸突变检测的探针组合物，其包括组装探针和报道探针，其中，报道探针和组装探针具有本发明第一方面所述相应定义。

69、具体地，待测dna的两条链分别记为a链、b链，待测链为a链。

70、具体地，待测dna的长度可以为，例如，10-500bp，特别是80-200bp。

71、具体地，报道探针包括探针f和探针q，其中探针f的部分核苷酸序列与a链的部分序列s1互补，且该序列s1包含待测突变(例如snv)位点ts；

72、探针q的核苷酸序列与探针f的核苷酸序列互补，且探针q的核苷酸序列长度小于探针f的核苷酸序列长度；

73、组装探针包含探针p1，其核苷酸序列与b链的部分序列s1'互补，且该序列s1'包含与a链待测突变(例如snv)位点ts互补的位点；

74、组装探针还包含多条探针pn(例如p2，p3，p4，…)，n为＞2的整数(例如3、4、5、6、7、8、9、10)，探针pn的核苷酸序列与b链的部分序列互补，且探针p1和pn的核苷酸序列均不相同(即不存在探针序列重叠的情况)；

75、优选地，组装探针还包含一条或多条探针pm'(例如p2'，p3'，p4'，…)，m为＞1的整数(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10)，探针pm'与a链的部分序列sm互补，并且探针pm'的核苷酸序列与探针f的核苷酸序列不相同(即探针pm'与探针f不存在序列重叠的情况，暴露出靶标检测窗口)。

76、即，探针f的核苷酸序列可分为f1段和f2段(即探针f由f1段和f2段组成)，其中f1段与a链的部分序列s1互补，f2段(reverse toehold)与a链不互补，但f2段与探针q互补。f2段与a链不互补并不影响探针f与a链的相互作用，而且这种设计有利于更有效地识别突变位点。

77、具体地，探针f的f2段的长度可以为4-8nt(例如4、5、6、7、8nt)，特别是5-6nt。

78、具体地，探针q的序列长度可以为15-40nt(例如15、16、18、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40nt)，特别是20-40nt。

79、具体地，探针f的序列长度与探针q的序列长度可以相差5-15nt(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15nt)，特别是6-8nt。

80、具体地，所述报道探针通过荧光标记；其中，探针f标记有荧光报告基团，探针q标记有荧光淬灭基团，例如，探针f的5’端标记有荧光报告基团，探针q的3’端标记有荧光淬灭基团(探针f从5’端开始与探针q(从3’端开始)互补，且探针f的长度大于探针q的长度)；或探针f的3’端标记有荧光报告基团，探针q的5’端标记有荧光淬灭基团(探针f从3’端开始与探针q(从5’端开始)互补，且探针f的长度大于探针q的长度)。

81、具体地，所述荧光报告基团可以为，例如，fam、texas red、rox、tet、vic、joe、hex、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、lc red640、lc red705等。

82、具体地，所述荧光淬灭基团可以为，例如，iowa black、tamra、dabcyl、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3等。

83、具体地，探针p1和所有探针pn(例如p2，p3，p4，…)的序列组合与a链的完整序列相同(即p1+p2+p3+p4+…＝a链)。

84、具体地，探针pm'中的一条或多条可以与探针pn中的一条或多条互补，且相互补的探针序列长度不同。

85、具体地，组装探针的序列长度可以为12-40nt(例如15、16、18、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40nt)。

86、具体地，相互补的探针序列长度不同，可以相差5-15nt(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15nt)，特别是5-8nt。

87、具体地，所有探针pm'(例如p2'，p3'，p4'，…)与探针f的序列组合长度小于等于b链的完整序列长度；在本发明的一个实施例中，一条或多条探针pm'(例如p2'，p3'，p4'，…)与探针f的序列组合为b链的完整序列。

88、在本发明的一些实施例中，n为3、4或5。

89、在本发明的一些实施例中，m为2、3或4。

90、在本发明的一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4。

91、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'，其中，p2'与p2、p3、p4均不互补。

92、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同。

93、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'、p3'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同，p3'与p2、p3、p4均不互补。

94、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4，以及p2'、p3'、p4'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同，p3'与p3互补且p3'的序列长度与p3不同，p4'与p4互补且p4'的序列长度与p4不同。

95、在本发明另一个实施例中，组装探针包含探针p1、p2、p3、p4、p5，以及p2'、p3'，其中，p2'与p2互补且p2'的序列长度与p2不同，p3'与p3互补且p3'的序列长度与p3不同。

96、具体地，序列s1'与序列s1部分互补(序列s1'与s1不完全互补)。

97、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr l858r突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.28所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.29所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.14、15、20、21、22所示。

98、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr 19del突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.16、17、23、24。

99、在本发明另一些实施例中，所述核酸突变为egfr 19del突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.34、17、23、24所示。

100、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr t790m突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.32所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.18、19、25-27所示。

101、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr l858r突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.44-48所示。

102、在本发明另一些实施例中，所述核酸突变为egfr 19del突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.49-52所示。

103、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr t790m突变，所述报道探针f的核苷酸序列如seq id no.32所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.53-56所示。

104、在本发明的一些实施例中，所述检测为多重检测(同时检测同一待测dna中一个或多个单核苷酸变异位点，或同时检测多个不同待测dna)，可以将不同针对不同靶标的探针组合同时进行检测，例如所述核酸突变为egfr l858r突变、egfr 19del突变和egfr t790m突变，所述报道探针f的核苷酸序列分别如seq id no.28、30、32所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.29、31、33所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.14、15、20、21、22、34、17、23、24、18、19、25-27所示(如本发明实施例3所示)(此时针对不同snv的报道探针可采用不同的互不干扰的荧光标记，实现多通道的信号读出)。

105、本发明还提供一种设计用于核酸突变检测的探针的方法，其中所述探针如本发明第二方面所述。

106、在本发明第三方面，提供一种用于核酸突变检测的试剂盒，其包含第二方面所述的探针组合物。

107、具体地，所述试剂盒还可以包含缓冲液，例如tris缓冲液，可用于溶解dna，稳定储存dna。

108、具体地，所述试剂盒还可以包含螯合剂，例如edta，可抑制dna酶的活性，防止dna被酶降解。

109、具体地，所述试剂盒还可以包含核苷酸保护剂，如tween 20，用于防止稀释和移液等过程中dna寡核苷酸的潜在损失；其中，核苷酸保护剂的含量可以为0.1％-1％(v/v)。

110、在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒包含：te缓冲液，0.5％tween 20，探针组合物。

111、具体地，上述试剂盒还包含标准品，其序列与无变异的待测dna相同(也称为野生型(wt))，可通过人工合成。

112、具体地，上述试剂盒还可包含阴性对照品，其为不含待测dna的体系，例如h2o(如无菌双蒸水、无菌去离子水等)。

113、具体地，上述试剂盒还可以包含dna扩增试剂和材料，用于(例如通过pcr)扩增待测dna，可以采用现有技术已知任何合适的用于dna扩增的试剂和材料。

114、在本发明的一个实施方式中，上述试剂盒还包含抑制链置换扩增(bda)试剂和材料，例如引物和抑制链(blocker)。

115、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr l858r突变，所述引物的核苷酸序列分别如seq id no.35、36所示，所述抑制链的核苷酸序列如seq id no.37所示；更具体地，此时试剂盒中的报道探针f的核苷酸序列如seq id no.12所示，报道探针q的核苷酸序列如seq id no.13所示，组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.44-48所示(如本发明实施例4所示)。

116、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr 19del突变，所述引物的核苷酸序列分别如seq id no.38、39所示，所述抑制链的核苷酸序列如seq id no.40所示；更具体地，此时试剂盒中的报道探针f的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.49-52所示(如本发明实施例4所示)。

117、在本发明的一些实施例中，所述核酸突变为egfr t790m突变，所述引物的核苷酸序列分别如seq id no.41、42所示，所述抑制链的核苷酸序列如seq id no.43所示；更具体地，此时试剂盒中的报道探针f的核苷酸序列如seq id no.32所示，所述报道探针q的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述组装探针的核苷酸序列分别如seq id no.53-56所示(如本发明实施例4所示)。

118、具体地，上述试剂盒还可以包含dna提取试剂和材料，用于(例如从组织、血液、细胞样本或其他样本中)提取待测dna，可以采用现有技术已知任何合适的用于dna提取的试剂和材料。

119、具体地，必要时，上述试剂盒还可以包含待测样品预处理试剂，该预处理试剂可以采用现有技术已知用于预处理样品以便于dna提取的试剂，例如，生理盐水等。

120、在本发明第四方面，提供第二方面所述探针组合物、第三方面所述的试剂盒在制备用于疾病的诊断、患病风险评估、疗效评估、预后的产品中的应用。

121、具体地，该疾病与基因突变有关。

122、在本发明的一个实施方式中，上述疾病为肿瘤，特别是恶性肿瘤，包括，但不限于，肾上腺癌、肛门癌、血管肉瘤、阑尾癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、支气管癌、类癌瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、脊索瘤、颅咽管瘤、结肠直肠癌、结缔组织癌、上皮癌、室管膜瘤、内皮肉瘤、子宫内膜癌、食管癌、尤文氏肉瘤、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞癌、头颈癌、血液系统恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(mm))、成血管细胞瘤、下咽癌、炎性肌纤维母细胞瘤、免疫细胞性淀粉样变性、肾癌、肝癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、平滑肌肉瘤(lms)、肌肉癌、间皮瘤、骨髓增生性疾病(mpd)、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、神经内分泌癌、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状腺癌、胰腺癌、阴茎癌、松果体瘤、原始神经外胚层肿瘤(pnt)、前列腺癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、皮脂腺癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、外阴癌。在本发明的一些实施例中，该疾病为肺癌。

123、在本发明第五方面，提供一种用于疾病的诊断、患病风险评估、疗效评估、预后的方法，其包括使用本发明上述检测方法、探针、试剂盒进行核酸突变检测的步骤。

124、具体地，该疾病与基因突变有关。

125、在本发明的一个实施方式中，上述疾病为肿瘤，特别是恶性肿瘤，包括，但不限于，肾上腺癌、肛门癌、血管肉瘤、阑尾癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、支气管癌、类癌瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、脊索瘤、颅咽管瘤、结肠直肠癌、结缔组织癌、上皮癌、室管膜瘤、内皮肉瘤、子宫内膜癌、食管癌、尤文氏肉瘤、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞癌、头颈癌、血液系统恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(mm))、成血管细胞瘤、下咽癌、炎性肌纤维母细胞瘤、免疫细胞性淀粉样变性、肾癌、肝癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、平滑肌肉瘤(lms)、肌肉癌、间皮瘤、骨髓增生性疾病(mpd)、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、神经内分泌癌、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状腺癌、胰腺癌、阴茎癌、松果体瘤、原始神经外胚层肿瘤(pnt)、前列腺癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、皮脂腺癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、外阴癌。在本发明的一些实施例中，该疾病为肺癌。

126、具体地，该方法可包括如下步骤：

127、(1)获取受试者样本；

128、(2)提取dna；

129、(3)核酸突变检测。

130、具体地，检测样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料；特别是，组织(例如肿瘤组织、癌旁组织)、血液(特别是外周血)或其级分(例如血浆)、细胞。

131、本发明提出了扩增后无偏差的dna组装技术(poster amplification non-biasdna assembly,panda)用于超特异性、超灵敏的低丰度的癌症相关的突变检测。通过设计不同的panda探针，不仅可以破坏突变靶标本身的二级结构，暴露出检测窗口；而且改变原来的单调递增的s形滴定曲线为单峰曲线，大大地拓宽了检测窗口。由于panda技术克服了靶标间的交叉影响，故极易实现突变靶标的多重检测。panda探针设计简单，无需修饰功能性核酸，使dna突变检测对临床和科研人员更加经济。此外，结合panda和pcr富集技术，实现低至0.01％的基因突变检测。以肺癌组织样品和肺癌血浆样品为例，本发明所提出的技术可成功检测其中的egfr突变。