一种快速检测大豆基因耐盐性的方法与流程

1.本发明涉及耐盐性鉴定技术领域，具体涉及一种快速检测大豆基因耐盐性的方法。


背景技术：

2.在验证大豆基因耐盐性时，经常会利用转基因植株进行生理指标的检测来进行功能验证，无论是转基因植株的获得还是生理指标的检测，工作强度和周期都较长，费时费力。


技术实现要素：

3.发根农杆菌侵染植株所产生的发根具有生长速度快，分化程度高，生理生化和遗传性稳定、易于操作等特点，利用发根接种大豆下胚轴能够快速得到根部阳性的转基因大豆植株，而叶片颜色变化是反映植物内在生理功能和生长状态的重要特征，利用数字化技术定量描述叶片颜色动态，能够准确快速反应植物的生理变化，基于此，本发明提供了一种快速检测大豆基因耐盐性的方法。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种快速检测大豆基因耐盐性的方法，通过crispr/cas9基因编辑技术，抑制目的基因表达，然后通过发根农杆菌接种于大豆下胚轴，待发根长至5～10 cm时，盐胁迫处理15～18 h，获取倒一展开复叶的图像；提取图像cmyk模式下c值，根据c值将耐盐性分为5级，由低到高分别为ⅰ级（c值》40）、ⅱ级（40≥c值》35）、ⅲ级（35≥c值》25）、ⅳ级（25≥c值》15）和
ⅴ
级（15≥c值》5.0）。具体地，在室内用手机拍摄获取倒一展开复叶的图像，手机设置为自动调焦，关闭闪光灯，采用自动白平衡模式，图像采集完成后，用photoshop cc 2017打开图像，在cmyk模式下，利用矩形工具，选取叶片中部从叶尖到叶基，用切割工具进行切割，切割宽度为叶宽值的1/4大小，然后用标尺计算切割的叶长，分别在叶片的1/5、2/5、1/2、3/5、4/5处用矩形工具选取叶长值的1/20作为待测区域，在每个待测区域用吸取工具随机选5个区域进行吸取，得出颜色的平均值，用 c值表示叶片的颜色。
5.上述方案中，利用发根接种大豆下胚轴能够快速得到根部阳性的转基因大豆植株的特点，利用数字化技术定量描述叶片颜色动态，能够准确快速的实现大豆基因耐盐性的检测。
附图说明
6.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1 盐胁迫下不同基因发根苗倒一展开复叶叶色和c值的变化。
7.图2 盐胁迫下不同基因发根苗倒一展开复叶待测区域取样。
8.图3 盐胁迫下不同基因发根苗倒一展开复叶叶绿素（a）和mda（b）含量的变化。
9.图4 盐胁迫下不同基因发根苗倒一展开复叶叶绿素含量和c值相关性（a）与mda含量和c值相关性（b）。
10.图5 盐胁迫下不同基因发根苗致死率（a）和生物量（b）的变化。
11.图6 盐胁迫下不同基因发根苗致死率和c值相关性（a）与生物量和c值相关性（b）。
12.图7 盐胁迫下不同基因发根苗产量的变化。
具体实施方式
13.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
14.一、水培试验通过crispr/cas9基因编辑技术，将k599和待测基因（a、b、c、d、e和f）接种于徐豆18（江苏省区域试验对照用种）下胚轴，待发根长至5 cm左右时，将其用蒸馏水小心冲洗干净。然后，将发根苗置于包有锡箔纸的锥形瓶内，根部完全浸没于蒸馏水中，使发根苗恢复12 h。最后，将发根苗移至150 mm nacl溶液中，根部浸没18 h，以k599发根苗蒸馏水作对照（ck）。取倒一展开复叶的中间小叶，拍照后放入液氮冷冻、-40℃保存。
15.图像采集和颜色特征c值提取：在室内用手机进行拍摄，手机设置为自动调焦，关闭闪光灯，自动白平衡模式。用photoshop cc 2017打开图像，在cmyk模式下，利用矩形工具，选取叶片中部从叶尖到叶基，用切割工具进行切割，切割宽度为叶宽值的1/4大小。用标尺计算切割的叶长，分别在叶片的1/5、2/5、1/2、3/5、4/5处用矩形工具选取叶长值的1/20作为待测区域，在每个待测区域用吸取工具随机选5个区域进行吸取，得出颜色的平均值，用 c值表示叶片的颜色。
16.从图1可见，不同耐盐性基因的发根苗在150 mm盐溶液中处理18 h时，叶色呈现不同颜色，随着叶片逐渐失绿，c值逐渐降低。
17.叶绿素含量测定方法：称取0.08 g冷冻叶片置于95%乙醇中，3 ml离心管提取，在室温下避光浸提放置24 h。取上清液，在470 nm、649 nm和665 nm下以95%乙醇为空白，测吸光值，代入公式计算。叶绿素总含量(mg/g)= (18.08
×
od
649-6.63
×
od
665
)
×
0.005/m (m为叶片质量)。
18.丙二醛（mda）含量测定方法：称取0.1 g冷冻叶片加入3 ml三氯乙酸（tca）研磨后，4 000 rpm离心15 min。取2 ml上清液，加2 ml含0.67%硫代巴比妥酸（tba）的tca溶液。沸水浴30 min后立即置于冰浴中冷却，4 000 rpm离心10 min后，取3 ml上清液于450 nm、532 nm和600 nm处比色，代入公式计算。
19.叶绿素总含量(mmol/g)=[6.452
×
(od
532-od
600
)-0.559
×
od
450
]
×
4/(3
×
m) (m为叶片质量)。
[0020]
叶色变化与叶绿素含量密切相关。逆境下，植物叶绿素合成会受到抑制，叶绿素含量下降。由图3可见，与ck相比，不同耐盐性基因发根苗在150 mm盐溶液中处理18 h时，叶片中叶绿素含量下降，且从a基因到f基因发根苗，叶绿素含量逐渐下降。植物在逆境下遭受伤害，往往发生膜质过氧化作用，mda是膜脂过氧化作用的产物之一，其含量可以反映植物遭
受逆境伤害的程度。与之相反，盐胁迫下从a基因到f基因发根苗mda含量呈逐步增加趋势，表明从a基因到f基因，耐盐能力逐渐下降。
[0021]
由图4可见，叶绿素含量与c值呈显著正相关，相关系数为0.9683（图4.a）；mda含量与c值呈显著负相关，相关系数为0.9811（图4.b）。该结果表明，不同基因耐盐性可能用倒一展开复叶c值表征。综合c值、叶绿素含量和mda含量，可将耐盐性分为5级，由低到高分别为ⅰ级（c值》41.7）、ⅱ级（41.7≥c值》34.5）、ⅲ级（34.5≥c值》26.6）、ⅳ级（26.6≥c值》17.8）和
ⅴ
级（17.8≥c值》9.0）。
[0022]
二、营养液试验为了明确c值对耐盐性的表征能力，待发根长至5 cm左右时，将不同基因发根苗放置于包有锡箔纸的锥形瓶，根部完全浸没于蒸馏水中，让发根苗恢复12 h。然后，将发根苗移至300 mm盐胁迫营养液（用1/2霍格兰营养液配制）中，根部浸没6 d，以k599发根苗浸入1/2霍格兰营养液作对照（ck）。测定发根苗致死率、株高。然后，将植株在105℃杀青20 min，65℃烘干至恒重。
[0023]
由图5可见，与ck相较，盐胁迫处理6 d时，不同基因发根苗致死率和生物量下降，且从a基因到f基因发根苗，下降幅度逐渐增加。
[0024]
从图6可知，不同基因发根苗致死率和生物量均与c值呈正相关，相关系数分别为0.9861（图6.a）和0.9801（图6.b）。该结果进一步表明，不同基因耐盐性可用倒一展开复叶c值表征。
[0025]
三、土壤培养试验为了进一步明确c值对耐盐性的表征能力，待发根长至5 cm左右时，让发根苗采用上述的步骤恢复12 h。然后，将发根苗移至塑料盆（直径20 cm、高度25 cm）中。土壤风干后粉碎过筛，土壤颗粒直径小于3 mm，盆底端有盆垫，以便渗出水返回盆中，土壤中加入nacl的浓度作为盐胁迫土壤，依土重计算，即每100 g土壤中加0.05 g nacl；每盆装土5 kg，土壤中有机质、n、p2o5、k2o分别为 17.66、0.15、0.18和0.12 g
·
kg-1
。以k599发根苗移入不含nacl土壤作为对照，成熟期测定产量。
[0026]
由图7可见，与ck相较，盐胁迫导致不同基因发根苗产量下降，且从a基因到f基因发根苗，下降幅度逐渐增加。
[0027]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。