检测山杨基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方法

检测山杨基因组的pcr特异性引物以及pcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及检测杨树种类的引物以及pcr检测方法，尤其涉及检测山杨(populus davidiana dode)基因组的pcr特异性引物以及pcr检测方法，属于山杨基因组的pcr检测领域。


背景技术：

2.目前针对不同树种鉴定的引物主要以ssr为主，但ssr引物存在于所有物种中，基因组水平不够特异，迄今为止，缺少仅针对山杨的基因组特异的鉴定引物，这种特异引物可以快速鉴定出某一树种中是否有山杨的基因组成分，从而可以推断山杨是否参与了该树种的形成。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一是提供准确鉴别山杨基因组的特异性pcr引物对；
4.本发明的目的之二是提供一种快速区分山杨与其他杨属树种的pcr检测方法；
5.本发明的目的之三是提供一种检测山杨基因组的pcr检测试剂盒。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
7.本发明的一方面是提供了将山杨与其它杨树基因组相区分的特异性pcr引物对，选自引物对1或引物2中的任何一对；所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为：ccgaaaatgagctgggggat，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为：agcagacagtgacctgcttc；所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为：agtacctcataagaccaccattc，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为：gagcagcattagccatcagttta。
8.本发明的第二方面是提供了一种快速区分山杨与其他杨属树种的pcr检测方法，包括：
9.(1)提取待检测的杨树样品dna；
10.(2)以提取的杨树样品dna为模板，以引物对1的上游引物和下游引物或者以引物对2所示的上游引物和下游引物为pcr扩增引物建立pcr反应体系进行pcr扩增；
11.(3)如果扩增结果出现了特性性的扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有山杨基因组成分。
12.作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所建立的pcr反应体系包括：待检测的样品dna 2μl，pcr mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，双蒸水7μl。
13.作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的pcr扩增的程序包括：95℃5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，12℃,∞。
14.作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(3)中如果是以引物对1的上游引物和下游引物为pcr扩增引物建立pcr反应体系进行pcr扩增，所述的特异性的扩增条带的碱基长度是739bp；如果是以引物对2的上游引物和下游引物为pcr扩增引物建立pcr反应体系
进行pcr扩增，所述的特异性的扩增条带的碱基长度是484bp。
15.本发明的第三方面是提供了一种检测山杨基因组的pcr检测试剂盒，包括：taq酶，dntp，mg
2+
，ddh2o和pcr扩增引物；其中，所述的pcr扩增引物选自引物对1或引物2中的任何一对；所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为：ccgaaaatgagctgggggat，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为：agcagacagtgacctgcttc；所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为：agtacctcataagaccaccattc，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为：gagcagcattagccatcagttta。
16.本发明提供的鉴别山杨基因组的特异性pcr引物对可以快速区分山杨与其他杨属树种，采用pcr检测方法扩增及琼脂糖凝胶电泳操作方便，带型简单，不需要测序直接通过扩增片段即可区分出山杨特异基因组片段，有效节省人力物力，在杨树种植资源分类、利用及杂交种的鉴定方面具有很好的应用前景。
附图说明
17.图1山杨基因组特异引物筛选过程中特异性引物和部分非特异性引物pcr扩增的结果；1-5分别为银白杨、新疆杨、响叶杨、山杨和水(阴性对照)。
具体实施方式
18.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
19.试验例1鉴定山杨基因组的特异pcr引物的筛选
20.1、试验材料
21.银白杨(populus alba l.)、新疆杨(populus alba var.pyramidalis bge.)、响叶杨(populus adenopoda maxim.)、山杨(populus davidiana dode)的基因组dna和水(阴性对照)。
22.基于本发明人实验室前期获得的四种杨树(银白杨、新疆杨、响叶杨、山杨)的基因组，通过全基因组序列比对分析，发现基因组中具有较大差异的片段，并据此设计每种杨树特异引物，每条染色体设计100对引物(表1中只列举了所设计的部分引物的核苷酸序列)，然后通过pcr扩增进行引物的筛选，选出在山杨基因组中的特异扩增的引物。
23.表1列出了部分的采用同样设计原理和方法所设计的区分山杨基因组的扩增引物。
24.表1设计的用于特异扩增山杨基因组的部分pcr引物
[0025][0026]
2、试验方法
[0027]
利用上述筛选出的引物组，对四种杨树(银白杨、新疆杨、响叶杨、山杨)的基因组进行pcr扩增。
[0028]
pcr反应体系(20μl)：dna 2μl(10-30ng/μl)，pcr mix 10μl(sangon biotech,shanghai)，上游引物0.5μl(10μm)，下游引物0.5μl(10μm)，纯水7μl。
[0029]
pcr反应程序：95℃5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，12℃,∞。产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据条带结果，选出在山杨基因组存在特异条带的引物。
[0030]
3、试验结果
[0031]
区分标准为条带的有无，如在4号泳道出现条带则为检测出山杨基因组成分。
[0032]
由图1的扩增结果可见，表1所列举的20对引物中惟有chr01b-4和chr19b-3这两对引物能够特异性的扩增出山杨基因组的单一特异性条带，其余的18对引物中可同时扩增出其它杨树的相应片段或无法扩增出山杨基因组的单一特异性条带，因此，这18对引物均不能应用于山杨基因组的检测；其中，在chr01b-4和chr19b-3这两对检测引物中，chr01b-4的扩增效果更佳，其检测的特异性和灵敏度明显优于chr19b-3，因此，本发明优选采用chr01b-4作为检测山杨基因组的特异性引物。


技术特征：
1.将山杨(populus davidiana dode)与其它杨树基因组相区分的特异性pcr引物对，其特征在于，选自引物对1或引物2中的任何一对；所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为：ccgaaaatgagctgggggat，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为：agcagacagtgacctgcttc；所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为：agtacctcataagaccaccattc，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为：gagcagcattagccatcagttta。2.权利要求1所述的特异性pcr引物对在检测山杨基因组中的应用。3.一种将山杨(populus davidiana dode)与其他杨属树种相区分的pcr检测方法，其特征在于，包括：(1)提取待检测的杨树样品dna；(2)以提取的杨树样品dna为模板，以权利要求1的引物对1的上游引物和下游引物为pcr扩增引物对建立pcr反应体系进行pcr扩增；(3)如果出现了特异性的扩增条带，则表明待检测的杨树样品中含有山杨基因组成分。4.根据权利要求3所述的pcr检测方法，其特征在于，所述的特异性的扩增条带的碱基长度是739bp。5.一种将山杨(populus davidiana dode)与其他杨属树种相区分的pcr检测方法，其特征在于，包括：(1)提取待检测的杨树样品dna；(2)以提取的杨树样品dna为模板，以权利要求1的引物对2的上游引物和下游引物为pcr扩增引物对建立pcr反应体系进行pcr扩增；(3)如果出现了特异性的扩增条带，则表明待检测的杨树样品是山杨。6.根据权利要求5所述的pcr检测方法，其特征在于，所述的特异性的扩增条带的碱基长度是484bp。7.根据权利要求3或5所述的pcr检测方法，其特征在于，步骤(2)中所建立的pcr反应体系包括：待检测的样品dna 2μl，pcr mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，双蒸水7μl。8.根据权利要求3或5所述的pcr检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的pcr扩增的程序包括：95℃5min，95℃30s，退火30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，12℃,∞。9.一种检测山杨基因组的pcr检测试剂盒，包括：taq酶，dntp，mg
2+
，ddh2o和pcr扩增引物对；其特征在于，所述的pcr扩增引物对选自引物对1或引物2中的任何一对；所述引物对1的上游引物的核苷酸序列为：ccgaaaatgagctgggggat，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为：agcagacagtgacctgcttc；所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为：agtacctcataagaccaccattc，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列为：gagcagcattagccatcagttta。10.权利要求9所述的pcr检测试剂盒在检测山杨基因组中的应用。

技术总结
本发明公开了检测山杨基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方法。本发明基于银白杨、新疆杨、响叶杨和山杨的基因组，通过全基因组序列比对分析发现基因组中具有较大差异的片段，并据此设计每种杨树特异引物，从中筛选出能够将山杨基因组与其它杨树基因组进行准确区分的特异性引物。本发明进一步提供了应用该特异性引物建立快速区分山杨与其他杨属树种的PCR检测方法。本发明方法可以快速区分山杨与其他杨属树种，采用PCR检测方法操作方便，带型简单，不需要测序直接通过扩增片段即可区分出山杨特异基因组片段，在杨树种植资源分类、利用及杂交种的鉴定方面具有应用前景。杂交种的鉴定方面具有应用前景。杂交种的鉴定方面具有应用前景。


技术研发人员：安新民 薛胤轩 吴茹茜 陈婷婷 李影 鲁海琳 齐婉芯 郭斌
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2022.08.04
技术公布日：2022/9/20