结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法

结合crispr/cas12a与rpa检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种结合crispr/cas12a与rpa检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.随着病毒检测技术日益发展，现有的猴痘病毒的检测手段主要有形态学观察、血清学检测和分子生物学方法等。由于血清学诊断和临床诊断敏感性较低，病毒感染的快速特异性诊断主要采用分子诊断(pcr或real-time pcr)，然而real-time pcr技术对环境要求严格，仪器昂贵，不适合现场检测。近年来，利用重组酶聚合酶扩增(rpa)结合crispr-cas系统进行病原体检测在提高检测灵敏度的同时，可以大大缩短检测时间和对现场的仪器要求，但还没有应用到猴痘病毒(mpxv)的检测中。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足和填补空白，提供可以检测猴痘病毒核酸(mpxv)的crrna以及试剂盒。
4.为达成上述目的，本发明第一个技术方案如下：一种结合crispr/cas12a与rpa检测猴痘病毒方法，包括如下步骤：
5.步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的rpa扩增；
6.步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有cas12a酶、crrna的系统混合，并加入检测探针；
7.步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读。
8.本发明的第二个技术方案：一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒，包括检测猴痘病毒核酸的crrna-1或者crrna-2、lbcas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及basic试剂盒、depc水和10x nebuffer
tm r2.1。
9.本发明的第三个技术方案：一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒制备方法，包括如下步骤：
10.1)获取猴痘病毒mpxv的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；
11.2)设计得到检测猴痘病毒核酸的crrna-1、crrna-2：
12.crrna-1序列为taatttctactaagtgtagatttggaaaggtgttaaccctgtcac；
13.crrna-2序列为taatttctactaagtgtagatgtatataagttgtacggctaattc；
14.3)试剂盒的具体操作步骤如下：
15.在39℃条件下，rpa扩增mpxv f3l和b6r基因；
16.取上述体系加入cas12a系统，crrna与dsdna进行识别并结合，并激活cas12a酶活
性；cas12a酶随机切割ssdna fq探针；
17.荧光恒温放大器捕捉荧光信号，输出结果。
18.进一步，所述步骤1)具体步骤包括：在ncbi核酸序列库查找猴痘病毒mpxv的全基因组序列，锁定相对保守的f3l和b6r基因作为鉴定基因，寻找“tttn”序列，将这些序列作为crrna靶向序列的备选数据库，与其它正痘病毒属病毒相比,寻找备选数据库的中序列的特异性。
19.进一步，所述步骤2)具体步骤包括：根据筛选原则包含的序列的gc含量、碱基均一性、序列保守性参数,最终得到一段大小为20-24nt的靶位点识别序列,然后将一段大小为20-21nt的直接重复序列加上前述得到的大小为20-24nt的靶位点识别序列得到检测mpxv核酸的crrna,共得到2条,分别为crrna-1和crrna-2。
20.进一步，所述步骤3)具体步骤包括：
21.(1)用重组酶聚合酶rpa扩增试剂盒扩增目的片段，取2.2-2.5μl上游引物(f3l:taggagagttactaggccccac；b6r:ctaatgcggaatgtcaacctcttcaa)，2.2-2.5μl下游引物(f3l:acgacaatggatgctgatacac；b6r:agaaaatgtagatccggaaattaatc)(10μmol/l)，反应缓冲液，活化剂，加入dna模板和水的混合物，37-42℃孵育；
22.(2)取crrna和缓冲液与cas12a孵育，在20-28℃下放置，充分混合；
23.(3)将rpa反应体系和ssdna fq探针加入到crispr/cas12a混合体系中，反应在gs8等温循环仪中进行放置，荧光测量；
24.(4)crispr/cas12a结合rpa系统检测f3l和b6r基因的灵敏度，读取相对荧光值。
25.本发明的有益效果表现如下
26.1、为了便于早期疑似感染病例的准确诊断和快速稳定地检测样本，我们设计了一种rpa与crispr-cas12a相结合的猴痘病毒核酸检测试剂盒，可以快速、灵敏地检测mpxv。该检测系统可在30-40min内检测mpxv基因组dna，检测限为1copy/μl。
27.2、本发明将crispr/cas12a方法与荧光恒温放大器相结合，减少了现场检测对大型设备的依赖，形成了一种高灵敏度、低成本的mpxv检测工具。
附图说明
28.图1为本发明的一种检测猴痘病毒核酸的流程图；
29.图2为本发明选定的mpxv目的基因与其他病毒同源片段比对图；
30.图3为本发明所设计的crrna和引物的序列示意图；
31.图4为本发明使用便携式荧光恒温放大器(gs8等温循环仪)检测mpxv目的基因数据的示意图；
32.图5为本发明的检测mpxv片段的灵敏度示意图。
具体实施方式
33.以下结合附图以及具体实施方式，对本发明作进一步详细说明。
34.本发明一种结合crispr/cas12a与rpa检测猴痘病毒方法，包括如下步骤：
35.步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的rpa扩增；
36.步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有cas12a酶、crrna的
系统混合，并加入检测探针；
37.步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读
38.本发明提供了一种检测猴痘病毒(mpxv)核酸的试剂盒，包括检测猴痘病毒核酸的crrna-1或者crrna-2、lbcas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及basic试剂盒、depc水和10x nebuffer
tm r2.1。
39.本发明一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒制备方法包括以下步骤：
40.1、获取猴痘病毒(mpxv)的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；
41.2、设计得到检测猴痘病毒核酸的crrna-1、crrna-2；
42.3、试剂盒的具体操作步骤如下：如图1所示，在39℃条件下，rpa扩增mpxv f3l和b6r基因20min；取上述体系加入cas12a系统，crrna与dsdna进行识别并结合，并激活cas12a酶活性；cas12a酶随机切割ssdna fq探针(用fam和bhq1标记)；荧光恒温放大器(gs8等温循环仪)捕捉荧光信号，输出结果。
43.进一步地，所述步骤1中通过生物信息学分析对比，寻找mpxv特异性鉴定区域，具体步骤包括：
44.在ncbi核酸序列库查找猴痘病毒mpxv的全基因组序列，锁定相对保守的f3l和b6r基因作为鉴定基因，寻找“tttn”序列，将这些序列作为crrna靶向序列的备选数据库，与其它正痘病毒属病毒(varv、vacv、cpxv)相比,寻找备选数据库的中序列的特异性，如图2。
45.进一步地，所述步骤2中设计得到检测猴痘病毒核酸的crrna-1、crrna-2,具体步骤包括：
46.根据筛选原则,如序列的gc含量、碱基均一性、序列保守性等参数,最终得到一段大小为20-24nt的靶位点识别序列,然后将一段大小为20-21nt的直接重复序列加上前述得到的大小为20-24nt的靶位点识别序列得到检测mpxv核酸的crrna,共得到2条,分别为crrna-1和crrna-2,如图3所示。
47.进一步地，所述步骤3中检测mpxv f3l和b6r基因,具体步骤包括：
48.3.1用商业化的重组酶聚合酶(rpa)扩增试剂盒(twistamp,cat.no.tabas03kit)扩增目的片段，取2.2-2.5μl上游引物(f3l:taggagagttactaggccccac；b6r:ctaatgcggaatgtcaacctcttcaa)，2.2-2.5μl下游引物(f3l:acgacaatggatgctgatacac；b6r:agaaaatgtagatccggaaattaatc)(10μmol/l)，29.5μl反应缓冲液，2μl活化剂，加入dna模板和水的混合物使终浓度为50μl，37-42℃孵育20min。
49.3.2取2-4μl crrna(1μmol/l)(终浓度80nm左右)和3μl 10x缓冲液与1μl cas12a(1μmol/l)(终浓度30nm左右)(new england biolabs,cat.no.m0653s)孵育，在20-28℃下放置20分钟，充分混合。
50.3.3将20μl rpa反应体系和2-4μl ssdna fq探针(10μm,fam和bhq1标记)加入到crispr/cas12a混合体系中。反应在gs8等温循环仪中进行(gendx,cat.no.gs8)在37℃下放置10-20min，每30s进行一次荧光测量，如图4。
51.3.4 crispr/cas12a结合rpa系统在20min时检测f3l和b6r基因的灵敏度，便携式荧光恒温放大器(gs8等温循环仪)读取的相对荧光值如图5所示。
52.综上所述，本发明设计了一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒，可以快速、灵敏地检测mpxv。该检测系统可在40min内检测mpxv基因组dna，检测限为1copy/μl，形成了一种高灵敏度、高特异性、低成本的mpxv检测工具。
53.54.55.56.57.58.