一种对培养过程进行实时监测与检测的高通量厌氧培养装置的制作方法

1.本发明涉及一种厌氧培养容器，具体是涉及一种培养过程进行实时监测与检测的高通量厌氧培养微孔板，该微孔板同时能用于野外取样和厌氧液体培养。
2.发明背景
3.生物细胞的培养，在生物学研究过程中是非常重要的手段。虽然大部分的培养过程都是需氧的，但仍然有一部分生物细胞的培养是需要厌氧条件的，特别是一些兼性厌氧细胞和专性厌氧细胞。
4.为了营造厌氧环境，现有技术通常将所述培养板或培养皿置于培养容器中进行厌氧培养。例如，中国实用新型专利201920976181.x公开了一种厌氧性微生物培养箱，包括底架、培养室、取样室、气路通道和电控系统。该专利提供了一种气路系统简单，操作系统简单，设备体积小，占地小的厌氧培养箱。虽然该专利已经比现有技术的厌氧培养箱能够更好的提供厌氧环境，但依然需要一个固定场所和氮气瓶才能够实现厌氧的环境。
5.中国实用新型专利202022513468.4公开了一种新型厌氧培养箱，通过在培养槽内设置点火器，通过氢气储存罐内的氢气为燃料对箱体内的氧气进行燃烧，在厌氧菌生长过程产生氧气时，能及时通过对氧气的燃烧，避免氧气含量过多，影响厌氧菌的生长，在培养槽内设置营养水，通过水压作用使得水体时刻对投液口进行密封，保证密封的同时，可通过投液口向培养槽内注射营养物质，及时对厌氧菌提供养分。该专利的特点是需要借助氢气的燃烧才能够实现厌氧环境。
6.中国实用新型专利202120909469.2公开了一种厌氧培养器。包括乳胶手套、工作台和安装在工作台顶部的厌氧培养箱。该公开的特点是能保证乳胶手套留在厌氧培养箱内部，解决了传统乳胶手套吊在外部容易损坏的问题，对乳胶手套起到了良好的保护作用。
7.如上所述，已有的厌氧培养板、培养皿均需要放置在无氧容器或厌氧袋中。然而，这些技术的缺点在于：使用厌氧培养箱，存在结构复杂、成本过高的缺点。如果使用厌氧产气袋或厌氧袋进行培养，所述气袋一般具有固定的规格和大小，每次只能够对固定体积的空气进行厌氧处理，与待培养的生物细胞数量多少无关，且一旦封闭之后，无法对培养过程中的生物细胞状态进行监测。同时，如果只有单个培养板、培养皿的话，可以观察到菌落的生长，如果同时培养多个培养板、培养皿，则只能看到最外侧平板上的菌落生长状态。
8.此外，上述厌氧培养容器均存在产品体积过大，不适宜野外取样和培养。一直以来，在野外环境中进行厌氧微生物的取样与培养一直都很困难。其难点就在于很难在取样的同时给予样本提供厌氧的环境，而众所周知，一旦脱离了厌氧环境，大部分厌氧微生物都容易死亡。因此，为野外或其他没有培养条件的环境下的采样样本提供一个厌氧环境和厌氧的培养环境对于厌氧微生物的取样以及后期的培养而言是至关重要的。
9.因此，对于野外取样和快速厌氧培养的需求，现有技术中尝试改造培养板、培养皿来实现厌氧培养。例如，中国发明专利申请2011103309738公开了一种一次性厌氧菌培养平板，包括皿体、皿盖和托盘，其中托盘设在皿体和皿盖之间，其上端放置除氧透气袋和二氧化碳生成袋。该发明的技术思路在于，通过托盘上的除氧透气袋吸收氧气，二氧化碳生成袋
的化学物质与水反应生成二氧化碳，从而迅速生成无氧环境。由于该培养平板在托盘下的皿体为贯通的整体环境，实质上是一款比例缩小了的厌氧培养箱，除此之外还需要将托盘通过挂接平台设置在皿盖的支撑台上与皿盖连接，导致结构过于复杂，且需要使用昂贵的活泼金属除氧袋和含有化合物的二氧化碳生成袋，更重要的是，该平板需要使用琼脂粉，不能适合液体培养，因此不能满足高通量野外厌氧液体培养微量细胞样本的需求，而且由于皿盖与托盘之间放置了除氧袋和二氧化碳生成袋，使得不可能对内部培养的对象进行实时观察，更不用说能够对其进行检测。
10.综上所述，现有技术中对于厌氧培养主要只是提供厌氧的条件。对微生物的培养往往也局限于固体平板培养，并不能够实现液体培养，也不能进行实时的监测、检测，更不能达到高通量野外取样和快速厌氧培养的工作效率。与此同时，在以上现有技术实现方式中，还通常未考虑到微生物培养过程中产生的少量有毒气体，这些气体的产生与排放也有可能对环境和操作人员造成影响。
11.因此，现在需要一种能适用于高通量野外取样和快速液体厌氧培养的培养容器，该培养容器应当能独立维持厌氧和脱毒的环境，同时应具有易于观测和自动化监控的特定，以及适应于野外取样和厌氧培养的需要。


技术实现要素：

12.基于现有技术的缺陷，本发明原理之一是利用现有的微孔板，对其进行结构改造，增加了容纳除氧试剂的空间，从而能够取代昂贵和占地面积较大，需要通过其他气体或燃烧来实现厌氧环境的大型厌氧培养装置。
13.本发明原理之二，为了克服培养过程中产生的有毒有害气体，进一步增加了容纳脱毒试剂的空间，并优化了除氧试剂、脱毒试剂空间的比例。
14.本发明原理之三，在微孔板中进一步设置除氧指示剂、脱毒剂，以便随时监控厌氧环境和去除毒害气体。
15.本发明原理之四，为了实现高通量实时监控厌氧细胞生长状态，使用了透光性强的微孔板，配合覆盖高透光防菌膜，能够实现光学仪的自动监控。
16.本发明原理之五，在所述微孔板上设置二维码，配合可扫描二维码的装置，实现样本加载、培养过程参数(采样时间、采样地点、样本类型、样本名称、培养条件等)读取等多种需求。
17.因此，本发明是提供一种用于高通量厌氧培养细胞的微孔板，包括常规的微孔板主板和以及配套的覆膜，配合后整个板体呈矩形，其中：
18.(1)主板上平行设有多行排列的第一微孔，第一微孔可以根据生物培养需要设置为u型、v型以及平底型等形状，并且所述主板采用高透光材料，能适于液体培养，能从上部和底部清晰观测每个微孔中的细胞生长状态；
19.(2)主板长端的中间部分是用于培养细胞的第一微孔，两个短端分别设有1个第二微孔和多个第一微孔纵向合并的纵向孔；
20.(3)主板的四周边缘均略高于内部的微孔和纵向孔的上水平面，以便于在密闭状态下，微孔和纵向孔中的气体从上部流通；
21.(4)覆膜是高透光防菌膜，能隔绝空气和微孔中的气体交换；
22.(5)短端的纵向孔预置除氧试剂；
23.(6)第二微孔形状与第一微孔相同，并用于放置除氧指示剂。
24.在一个实施方案中，其中可以使用与主板匹配的顶盖来取代防菌覆膜，其中所述底盖是高透亮防菌盖。
25.在另一实施方案中，其中所述主板边缘的高度可以从0.1mm到10mm，优选的，所述主板边缘的高度可以从1mm到10mm，优选的，所述主板边缘的高度可以从2mm到8mm，优选的，所述主板边缘的高度可以从3mm到7mm，优选的，所述主板边缘的高度可以从4mm到6mm，最优选的，所述主板边缘的高度可以是5mm。
26.在上述任一实施方案中，所述主板还包含除氧试剂、除氧指示剂，和/或脱毒试剂。其中，所述主板的一端纵向孔、第二微孔分别预置除氧试剂、除氧指示剂，另一端的纵向孔预置脱毒试剂。
27.在上述任一实施方案中，所述除氧试剂是商用除氧试剂。在一个优选实施方案中，所述商用除氧试剂是三菱mgc除氧试剂。
28.在上述任一实施方案中，所述微孔板主板的侧面，还设有二维码，所述二维码经过培养的扫描装置识别后，可提供样本加载、培养过程参数(时间，地点，采样地点，样本类型、样本名称、培养条件等)等多种参数。
29.在上述任一的实施方案中，所述微孔板材料选自pmma、ps、pc、cr39、san、tpx以及各种光学树脂、透明玻璃钢。
30.在上述任一的实施方案中，其中所涉及的厌氧培养，是指对生物细胞的厌氧培养，包括，但不限于，微生物、动植物细胞，愈伤组织，类器官等由单个和/或多个细胞组成的单个细胞、多个细胞集合以及细胞组合等。
31.技术效果
32.1.现有的商用微孔板或是用于培养好氧菌，并不能用于液体培养培养厌氧菌。原因在于在有限的微孔板空间内，难以维持厌氧环境。本发明创造性地提出对常规商用的微孔板，对其进行结构改造后，获得结构简单、厌氧效果突出的厌氧培养微孔板，从而能够取代昂贵和占地面积较大，需要通过其他气体或燃烧来实现厌氧环境的大型厌氧培养装置。
33.2.本发明还增加了容纳脱毒试剂的空间，能够用于培养易产生有毒气体的生物细胞。
34.3.本发明为保证培养板的厌氧环境，可以使用多种商用除氧试剂。
35.4.本发明在微孔板中进一步设置除氧指示剂、脱毒剂，以便随时监控厌氧环境，同时防止了所述有害气体对于培养对象、操作人员与环境的危害。
36.5.本发明在所述微孔板上设置二维码，配合可扫描二维码的装置，如手动加样枪或自动加样器，实现样本加载、培养过程参数。
37.6.本发明产品结构小巧、紧凑，在无需其他除氧工作台或仪器的情况下，仅仅配合酒精灯火焰制造的无氧环境，即可实现野外快速采样、就地封装和厌氧培养，具有极大的便利性。
38.7.本发明产品完全采用高透光材料，如pmma、ps、pc、cr39、san、tpx以及各种光学树脂、透明玻璃钢，具有防腐蚀、重量轻、塑造性好、不易破损等优点，同时便于大量携带，并且具有在培养过程进行实时监测与检测的优点。
39.8.使用本发明所述培养装置，可以在加入除氧试剂指示剂和除氧试剂的条件下，在野外或其他没有培养条件的环境下进行采样时，预先加入液体厌氧培养基，可直接将所采样本放置培养装置，然后即时覆膜，这样就可以在取样的同时实现了厌氧环境，保证了采样的厌氧条件，为下一步的培养与分离提供了保证。
附图说明
40.图1是微孔板主板的立体图。
41.图2是覆盖薄膜的微孔板俯视图。
42.图3是微孔板侧视图。
43.图例说明：1.第一微孔；2.第二微孔；3.纵向孔；4.覆膜；5.二维码；6.微孔板主板边缘。
具体实施方式
44.为方便本领域相关技术人员了解本发明的技术特征，可参考以下实施例。所述实施例仅是对本发明所述主体的示范性使用，而并非是对本发明应用领域的局限。
45.实施例1、制备厌氧培养微孔板
46.如图1所示，一种野外取样的厌氧培养微孔板，包括微孔板主板和覆膜(未显示)。主板正面呈现矩形或长方形，可以是现有常规的细胞培养微孔板，例如48或96孔板，每孔可以为100、200甚至500ul等容积的容量。
47.主板下部是高约3-4cm的底座，主板正面平行设有多行排列的培养微孔，即第一微孔1。第一微孔的深度约2-10mm，优选5mm，可以根据生物培养需要设置为u型、v型以及平底型等形状，并且所述主板采用高透光材料(如pmma、ps、pc、石英等)，能适于液体培养，能从上部和底部清晰观测每个微孔中的细胞生长状态。
48.在主板的两侧短端的第一纵列，除保留1个微孔(即第二微孔2)外，通过模具将该纵列的剩余微孔通过挤塑、冲压或熔融等方式，形成1个纵向合并的纵向孔3。
49.主板中的微孔和纵向孔相对于四周边缘略微凹陷，使得主板四周边缘6均略高于(例如5mm)内部的微孔和纵向孔。当使用覆膜或底盖封闭或扣住该主板时，在密闭状态下，微孔和纵向孔中的气体可以从主板顶部的缝隙中流通。
50.在主板的一端纵向孔、第二微孔预置除氧试剂、除氧指示剂，另一端的纵向孔预置脱毒试剂，然后用高透光且防菌的覆膜或顶盖扣住，待取样时再打开。
51.另外，在微孔板主板的侧面，还设有二维码，所述二维码经过培养的扫描装置识别后，可提供样本加载、培养过程参数(时间，地点，采样地点，样本类型、样本名称、培养条件等)等多种参数。
52.实施例2、难辨梭菌的取样及厌氧培养
53.难辨梭菌(clostridium difficile)，又称为艰难梭状芽孢杆菌，是严格的专性厌氧型细菌，无荚膜，革兰染色阳性，形态粗长，形状为杆菌。有芽孢，芽孢可在环境中长期存活。通常在培养2天后有转为革兰阴性的趋向。主要分布于土壤、水、干草、沙、动物和人的粪便中，此外还大量存在婴儿的肠道中，是新生儿肠道中正常菌群。该菌可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等，目前是医院内感染的病原菌之一，尤其是在
不规范使用抗生素时，容易导致肠道菌群失调，耐药的艰难梭菌大量生长繁殖，导致抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎等疾病，这也是目前医院检验科较难进行检测的微生物之一。究其根源，就是难辨梭菌的采样和体外厌氧培养不容易实现。
54.难辨梭菌的厌氧培养基(mts，胰酶消化碎肉培养基)的配制：
55.将牛肉胰酶消化液500.0ml，牛肉浸液500.0ml，nacl 5.0g，葡萄糖5.0g，硫乙醇酸钠0.5g，碎肉渣10g，ph7.2～7.4。经113℃，灭菌30分钟后使用。根据实际情况，还可添加入d-环丝氨酸、头孢西丁，以及半胱氨酸盐酸盐、诺氟沙星、拉氧头孢等选择性物质。
56.对疑似粪便污染的样本，经预处理后，将样本接种于本发明所述微孔板中的第一微孔，然后在第二微孔中加入除氧指示剂(例如青岛海博氧气指示剂hbyy004)，在纵向孔中加入除氧试剂(例如三菱mgc除氧试剂)，然后覆膜密封之后，在35℃
±
1℃，进行培养。
57.实施例3
58.肉毒梭菌((clostridium botulinum)，在长时间暴露的肉类、罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，在繁殖过程中分泌肉毒毒素，因此是毒性最强的细菌之一。也是食物中毒的常见致病性微生物，因此对肉毒梭菌的取样与培养也是提升食品安全的重要技术支撑。
59.肉毒梭菌的厌氧培养基(庖肉培养基)的配制：
60.将牛肉浸液1000ml，蛋白胨30g、酵母膏5g、磷酸二氢钠5g、葡萄糖3g、淀粉2g、碎牛肉渣适量、ph 7.6。经113℃，灭菌15分钟后使用。
61.在疑似中毒的食品安全事故现场，使用无菌取样设备，将样本接种于本发明所述微孔板中的第一微孔，然后在一端第二微孔中加入除氧指示剂(例如青岛海博氧气指示剂hbyy004)，在纵向孔中加入除氧试剂(例如三菱mgc除氧试剂)，然后覆膜密封之后，在35℃
±
1℃，进行培养。
62.同时，设置未添加厌氧菌和培养基的空微孔板(预置除氧试剂及指示剂)，覆膜密封后，常温下保存作为对照实施例3。
63.实施例4
64.脱硫弧菌(desulfovibrio vulgaris)，是一类能够引起工业过程中金属腐蚀和人类健康问题微生物。不但需要较高的厌氧培养条件，而且会在培养过程中将含硫化合物转化为有毒的h2s。因此，如果在培养过程中能够将其所产生的硫化氢除去，对操作人员和环境都非常有益。
65.脱硫弧菌的厌氧培养基配制：
66.dl-乳酸钠2g,酵母浸出粉1g,mgso4.7h2o 2g,cacl.2h2o 0.1g，氯化铵1.0g，硫酸钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，feso4.7h2o 0.5g，巯基乙醇酸钠0.1g，维生素c 0.1g，经121℃，灭菌15分钟后使用。
67.在存在工业金属腐蚀的工作现场，使用无菌取样设备，将样本接种于本发明所述微孔板中的第一微孔，然后在一端第二微孔中加入除氧指示剂(例如青岛海博氧气指示剂hbyy004)，在纵向孔中加入除氧试剂(例如三菱mgc除氧试剂)。
68.在另一端纵向孔中加入脱毒试剂(例如宝利pds-600型脱硫脱氰催化剂)，覆膜密封之后，在36℃
±
1℃，进行培养。同时在其他孔中加入双歧杆菌作为培养对照。
69.取另一本发明所述培养装置进行对照实验，区别在于未加入脱毒试剂。经过培养
72hr后，可以发现在含有脱毒试剂的培养装置中，双歧杆菌的生长状况正常，而在未添加脱机试剂的装置中，双歧杆菌的生长状况明显迟缓。
70.同时，设置未添加厌氧菌和培养基的空微孔板(预置除氧试剂及指示剂和脱毒试剂)，覆膜密封后，常温下保存作为对照实施例4。
71.结果和分析
[0072][0073]
表1(每个实施例均平行检测2孔待测菌)
[0074][0075][0076]
表2.未加细菌和培养液的空置对照微孔板
[0077]
结论：
[0078]
(1)如表1所示，加入除氧剂后，除氧指示剂完全变色(由蓝变红，表示环境中不再含有氧气)，实施例2-3的时间明显长于实施例4，说明双重除氧试剂的维持厌氧环境的效果，优于一重除氧试剂的效果。
[0079]
(2)如表1所示，加入脱毒试剂后，实施例4能维持较长的脱毒时间，该时间足以完成有毒细菌的厌氧培养。因此使用本产品可以在实现厌氧培养的同时，可以去除厌氧培养过程中产生的有害气体。
[0080]
(3)如表2所示，未添加细菌和培养液的空置对照微孔板(即已包装密封的产品)，能维持长时间的无氧环境，其中双重除氧试剂的维持厌氧环境的效果，优于一重除氧试剂的效果。这有利于提前生产产品，随时用于野外采样。
[0081]
(4)考虑到野外取样过程中，配合能扫码的取样枪，能快速对取样时间、采样地点进行数据输入。当产生检测结果数据(确定的样本类型、样本名称、培养条件)后，使用扫码设备即可将取样微孔板与检测结果进行同步对应。