一种马氏珠母贝抗低温性状相关的SNP分子标记及其应用

一种马氏珠母贝抗低温性状相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于水产遗传育种技术领域，尤其涉及一种马氏珠母贝抗低温性状相关的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.海洋贝类是一种变温动物，其缺乏体温调节能力，体温与其生存环境的温度相同。因此，环境温度是影响贝类生命活动的最重要的环境因素之一，其变化直接影响贝类的存活、生长代谢、繁殖发育等各个方面，并决定了物种的地理分布。马氏珠母贝(pinctada fucata martensii)别名合浦珠母贝，隶属于软体动物门双壳纲，在我国主要分布在广东、广西以及海南等南海海域，是典型的暖水性贝类，适温范围15～30℃，最适生长温度为23～28℃，对低温的耐受能力较弱，水温下降到6～8℃超过21h就会大量死亡。因此，培育马氏珠母贝耐低温品系是开展扩展珍珠贝北移养殖，扩展珍珠贝养殖区域的前提。
3.目前传统的育种方法具有选育周期长、投资大、费时费力等缺点，筛选与抗低温相关的dna分子标记进行分子辅助育种对于加速抗寒性遗传改良至关重要。经过对现有技术的国内外文献检索，至今未见有perlucin基因和α-tubulin基因与马氏珠母贝耐低温相关的研究报告，也没有这两个基因的多态性位点与马氏珠母贝耐低温相关性的报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种马氏珠母贝抗低温性状相关的snp分子标记及其应用，该系列分子标记可精准的鉴定出具有抗低温性状的马氏珠母贝。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种马氏珠母贝抗低温性状相关的snp分子标记，所述分子标记包括snp351、snp352、snp362、snp365、snp367、snp378、snp396、snp456、snp718、snp823、snp831中的一种或多种；
7.其中：所述snp351位于perlucin基因第351位，多态性为c或t；
8.所述snp352位于perlucin基因第352位，多态性为g或t；
9.所述snp362位于perlucin基因第362位，多态性为a或g；
10.所述snp365位于perlucin基因第365位，多态性为c或t；
11.所述snp367位于perlucin基因第367位，多态性为a或g；
12.所述snp378位于perlucin基因第378位，多态性为a或t；
13.所述snp396位于perlucin基因第396位，多态性为a或g；
14.所述snp456位于perlucin基因第456位，多态性为a或g；
15.所述snp718位于α-tubulin基因第718位，多态性为g或t；
16.所述snp823位于α-tubulin基因第823位，多态性为a或c；
17.所述snp831位于α-tubulin基因第831位，多态性为a或g。
18.优选的，所述perlucin基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
19.优选的，所述α-tubulin基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
20.本发明提供用于扩增所述的snp分子标记的引物组，所述引物组包括如下位点中的一种或多种：
21.表1 snp分子标记及其引物组
22.[0023][0024]
本发明提供一种试剂盒，包括所述的引物组中的一种或多种。
[0025]
本发明提供所述的snp分子标记、或所述的引物组、或所述的试剂盒在马氏珠母贝抗低温性状鉴定中的应用，用于鉴定马氏珠母贝抗低温性状位点基因型。
[0026]
本发明提供一种评估马氏珠母贝抗低温性状的方法，包括如下步骤：
[0027]
(1)提取待测样品基因组dna；
[0028]
(2)以步骤(1)中的基因组dna为模板，利用所述引物组进行pcr扩增；
[0029]
(4)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或分子测序，获得分子标记的基因型；
[0030]
(5)根据基因分型结果，判断所述待测样本的抗低温性状。
[0031]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0032]
本发明首次发现perlucin基因和α-tubulin基因与马氏珠母贝耐低温相关，首次发现perlucin基因中snp351位点cc、snp352位点tt、snp362位点gg、snp365位点cc、snp367位点ag、snp378位点tt、snp396位点aa、snp456位点ag和α-tubulin基因中snp718位点gt、snp823位点ac、snp831位点ag为马氏珠母贝抗低温耐受能力优势基因型。
[0033]
本发明根据所述的snp351、snp352、snp362、snp365、snp367、snp378、snp396、snp456、snp718、snp823、snp831中的一种或多种设计的引物组可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型的鉴定，通过筛选具有多个优势基因型的亲贝，提高后代群体的耐低温能力。
附图说明
[0034]
图1snp351位点电泳结果示意图。
[0035]
图25个样本的测序峰。
具体实施方式
[0036]
本发明提供了一种马氏珠母贝抗低温性状相关的snp分子标记，所述分子标记包
括snp351、snp352、snp362、snp365、snp367、snp378、snp396、snp456、snp718、snp823、snp831中的一种或多种；其中：所述snp351位于perlucin基因第351位，多态性为c或t；所述snp352位于perlucin基因第352位，多态性为g或t；所述snp362位于perlucin基因第362位，多态性为a或g；所述snp365位于perlucin基因第365位，多态性为c或t；所述snp367位于perlucin基因第367位，多态性为a或g；所述snp378位于perlucin基因第378位，多态性为a或t；所述snp396位于perlucin基因第396位，多态性为a或g；所述snp456位于perlucin基因第456位，多态性为a或g；所述snp718位于α-tubulin基因第718位，多态性为g或t；所述snp823位于α-tubulin基因第823位，多态性为a或c；所述snp831位于α-tubulin基因第831位，多态性为a或g。本发明所述perlucin基因的核苷酸序列为：acatgggggtagcattccacactttgttacaagaagaccagaaatcgagtacaacatgaaagcattcctgactatttttgtattggcagcacttgctttttccatgataagttgttatgaaggctgtgggataggatggagacgatacagaaataaatgttacttgttcagtaataatcttgcggcgaactggattagcgcttcgaatttctgccgatccctgggaggaagactagccggcccccggaataggggagaacacggatttttgagaaggatagccaggcatagtagagaaggattgatatggattggcgttggagactttatagcagaaggaaaatggttaactttccctaatgcgcggtacgcaaagttcgtaaactggggtggcaatgaaccaaatggagggacaggggaaaactgtgccttaatggcgagtggatatgactacagatgggctgattattcctgtagtaatgtgtacaagttcatttgtgagaaggcaaaatagaatagactaatatatgtggtatatggaatgggatatgttattttgtctcacgaatatgaaagcaaaatgaaatataatgcaattgactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(seq id no.1)。所述α-tubulin基因的核苷酸序列为：atggtgggtgagcgtgcttccatgtcatgtggggacgaatcatacaatacattcttcaacgagacaagcgcgggaaaacatgtaccacgtgctatttacgtcgacctggaacctagcgttgttgacgaggtccgctgtagccaatacaaacagctcttccatccggagcagttgatcagcggcaaggaggacgctgccaataactacgccaggggacattacactgtaggcaaggagatagtggacctggtcctagacaaaatcaggaaactggcggacctatgtactggtcttcaaggtttcttggtgttccacagcttcggcggcggagccggaagtggattttcatcgttgctcatggaacgactctctgtagattacgggaggaaatcaaagctagaattcgccgtataccccgctccacagatctctactgcagtagttgagccttataactccatactgacaacccacaccacgttagaacattctgactgtgccttcatggtcgacaacgaggctatttacgacatctgtcgacgtaaccttgacatagaaaggccgtcctacaggaatctgaaccgtctgattggtcagatcgtctcctccatcacagcctcgctccggttcgacggcgcactcaatgtcgatctcacagagttccagacaaatctggtgccatatcccaggatccatttccctctagtcacatacgctcctatcatatcagctgagaaggctttccatgaacagatgtctgtgcaggagatcactaacgcttgttttgagcccagtaaccagatggttaagtgtgatccccgtaacggcaaatacatggcctgctgtatgttatataggggcgacgtggtccccaaggacgtcaatgcagcaatagccaccatcaagacaaagcggtctatacagtttgtagactggtgtccaacagggttcaaagtaggcatcaactaccagccgccaactatagtacctggtgatgacctagccaacgtccagagagcggtctgtatgttgagtaacactacggccatagccgaggcctggtcaaggcttgaccataaatttgatctcatgtactcaaagcgagcctttgtacactggtacgtcggtgaaggtatggaggagggtgagttttctgaagccagggaggatatggccgctctagagaaggattacgaagaggtcggcgtggaatcgacggaaaacggcgctgaagacgaggacgacatggaggaatactga(seq id no.2)。
[0037]
本发明提供所述的snp分子标记的引物组，包括如下表2中的一种或多种：
[0038]
表2 snp分子标记及其引物组
[0039]
[0040][0041]
在本发明中，所述引物组perlucin-f和perlucin-r是通过含有所述snp351、snp352、snp362、snp365、snp367、snp378、snp396、snp456分子标记的perlucin设计的；所述α-tubulin-f和α-tubulin-r是通过含有所述snp718、snp823、snp831分子标记的α-tubulin设计的。
[0042]
本发明提供一种试剂盒，包括所述引物组中的一种或多种。本发明试剂盒还包括dna聚合酶、10
×
聚合酶链式反应(pcr)缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸dntp混合液、氯化镁。本发明所述试剂盒用于鉴定马氏珠母贝抗低温性状。
[0043]
本发明提供所述snp分子标记或所述引物组在马氏珠母贝抗低温性状鉴定中的应用，用于鉴定马氏珠母贝抗低温性状位点基因型。本发明可鉴定出马氏珠母贝为抗低温选育系的优势基因型为：perlucin基因中的优势基因型分别为snp351位点cc、snp352位点tt、snp362位点gg、snp365位点cc、snp367位点ag、snp378位点tt、snp396位点aa、snp456位点ag，α-tubulin基因中的优势基因型分别为snp718位点gt、snp823位点ac、snp831位点ag。本发明若检测的马氏珠母贝为上述优势基因型中的一个或多个，则该样品为抗低温选育系培育的候选亲本，最终以具有较多上述优势基因型的个体为育种亲本。
[0044]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0045]
实施例1马氏珠母贝抗低温性状相关的snp分子标记的筛选
[0046]
1、耐低温选系的获得：
[0047]
从湛江养殖的基础群体(由北部湾野生群体w构建)中选取1200只健康的马氏珠母贝转移至汕头南澳岛养殖(最低水温10～11℃)，越冬后存活的个体作为亲本，将亲本通过人工繁殖培育耐低温选系f1，按获得f1的相同路线培育耐低温选系f2和f3，苗种培育和成体养殖按照常规方式进行，组成耐低温选系rf3。
[0048]
2、基因组dna提取：
[0049]
(1)从rf3和北部湾野生群体w中分别随机取30个个体，利用碳酸镁使其麻醉，剪取少量鳃组织装于冻存管，液氮速冻后置于-80℃冰箱备用。
[0050]
(2)参照海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(tiangen)说明书对步骤(1)中每个个体的鳃组织进行基因组dna提取，具体操作步骤如下：
[0051]
1)切取不多于30mg的闭壳肌组织，放入装有200ulga缓冲液的离心管中，涡旋振荡15s。
[0052]
2)加入4ul rnasea(100mg/ml)溶液，振荡15s，室温放置5min。
[0053]
3)加入20ul proteinasek(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁水珠。在56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁水珠，再进行下一步骤。
[0054]
4)加入200ul缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。
[0055]
5)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁水珠。
[0056]
6)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
[0057]
7)向吸附柱cb3加入500ul缓冲液gd(使用前先加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
[0058]
8)向吸附柱中加入600ul漂洗液pw(使用前先加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
[0059]
9)重复步骤8)。
[0060]
10)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0061]
11)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12000rpm离心30s，将溶液收集到离心管中，即得个体的基因组dna。
[0062]
3、全基因组重测序
[0063]
步骤2提取的dna样品的质量使用nanodrop-1000超微量紫外分光光度计和凝胶电泳检测，提取的dna样品的完整性使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；nanodrop-1000测定dna的浓度、dna中蛋白质和rna等污染情况。rf3群体和w群体共60个个体基因组dna检测合格后送往武汉华大测序，测序平台为illumina hiseqtm 2000，通过测序获得rf3和w的全基因组重测序数据库。
[0064]
4、确定perlucin和α-tubulin基因在马氏珠母贝全基因组中的位置
[0065]
根据seqidno:1和seqidno:2所示马氏珠母贝perlucin及α-tubulin基因序列，利
用bioedit软件对上述基因序列和马氏珠母贝全基因组精细图谱进行比对，分别获得perlucin和α-tubulin基因序列在马氏珠母贝全基因组的对应位置。
[0066]
5、提取相关的分子标记位点
[0067]
在rf3群体和w群体每个检测样本的全基因组重测序数据库中，通过上述步骤4获得的基因组对应位置利用ultraedit提取perlucin基因序列的第351、352、362、365、367、378、396、456位点的碱基；以及α-tubulin基因序列的第718、823、831位点的碱基。
[0068]
6、人工统计每个样本中perlucin和α-tubulin基因中上述11个snp位点的基因型。
[0069]
7、利用spss 22.0的卡方检验马氏珠母贝耐低温能力与11个snp位点基因型间进行关联分析，分析结果如表3：
[0070]
表3耐低温能力与11个snp基因型间的关联分析结果
[0071][0072]
由表3关联分析结果显示，perlucin基因snp351位点cc、snp352位点tt、snp362位点gg、snp365位点cc、snp367位点ag、snp378位点tt、snp396位点aa、snp456位点ag；α-tubulin基因snp718位点gt、snp823位点ac、snp831位点ag在rf3中基因型频率显著高于w群体，表明这些基因型跟马氏珠母贝耐低温性状显著相关，可以作为马氏珠母贝耐低温性状辅助选择的标记。
[0073]
实施例2 snp分子标记引物的设计和snp位点基因型的判定
[0074]
1、snp分子标记引物的设计
[0075]
基于含有基因位点snp351、snp352、snp362、snp365、snp367、snp378、snp396、snp456的perlucin基因序列和含有基因位点snp718、snp823、snp831的α-tubulin基因序列，利用软件primer5.0以及人工选择分别对不同的位点设计特异性扩增引物，各位点的引物序列如表2所示。
[0076]
2、snp位点基因型的判定：利用四引物扩增受阻突变体系pcr技术对位点进行基因型分析。
[0077]
(1)基因组dna的提取：根据实施例1步骤2提取样品基因组dna。
[0078]
(2)pcr扩增：以设计的引物序列对样品的dna进行扩增，反应扩增体系15μl：包括
0.2μldna聚合酶(5u/μl)、1.5μl10
×
聚合酶链式反应(pcr)缓冲液、1.2μl脱氧核糖核苷三磷酸dntp混合液(各2.5mm)、0.4μl氯化镁(25mm)、上下游外引物各0.3μl、上下游内引物各1.5μl、双蒸水6.6μl。程序设定为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1：10min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃恒温保存，即得扩增产物。
[0079]
(3)检测扩增产物以及snp位点基因型判定：扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察凝胶图谱中电泳条带，判定样品的基因型。
[0080]
以位点snp351为例，snp351-f1和snp351-r2为阳性对照，扩增片段为357bp；snp351-f2和snp351-r2扩增片段为153bp；snp351-f1和snp351-r1扩增片段为252bp；扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶图谱中，仅有357bp条带表明没有突变位点，有357bp和252bp条带的为tt纯合子，有357bp和153bp条带的为cc纯合子，有357bp、252bp和153bp条带的为ct杂合子，详见图1snp351位点电泳结果示意图，然后根据表3分析结果指出各位点的优势基因型，判定样品是否为抗低温选育系。其余位点的判定依次类推。
[0081]
实施例3 snp分子标记引物的设计和snp位点基因型的判定
[0082]
1、snp分子标记引物的设计
[0083]
基于含有基因位点snp351、snp352、snp362、snp365、snp367、snp378、snp396、snp456的perlucin基因序列和含有基因位点snp718、snp823、snp831的α-tubulin基因序列，利用软件primer5.0以及人工选择设计特异性扩增引物，引物序列如表4所示。
[0084]
表4扩增引物
[0085][0086]
2、snp位点基因型的判定：对扩增产物进行序列分析。
[0087]
(1)基因组dna的提取：根据实施例1步骤(2)提取样品基因组dna。
[0088]
(2)pcr扩增：以设计的引物序列对样品的dna进行扩增，反应扩增体系10μl：包括3.8μlddh2o、0.4μl基因组dna、0.4μl上游特异性引物f，0.4μl下游特异性引物r、5μlprimestar。程序设定为：95℃预变性5min；98℃变性15s，59℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃恒温保存，即得扩增产物。
[0089]
(3)snp位点的基因型：将扩增产物送至广州生工生物工程有限公司进行测序，获得扩增序列信息。
[0090]
测序结果可知，由特异性引物perlucin-f和perlucin-r扩增反应所得产物为含上述8个snp位点的perlucin基因序列，序列如seqidno:1所示。检测该序列第351、352、362、365、367、378、390、396、456bp处碱基，判断样本的基因型；由特异性引物α-tubulin-f和α-tubulin-r扩增反应所得产物为含上述3个snp位点的α-tubulin基因序列，序列如seqidno:2所示，检测该序列第718、823、831bp处碱基，判断样本的基因型。
[0091]
根据上述技术方案对来源于耐低温选育群体f3代的5个马氏珠母贝个体样本进行鉴定，鉴定结果见表5和图2。由表5和图2结果可知，5个测序个体都具有perlucin基因的6有优异基因型，分别是snp351位点cc、snp352位点tt、snp362位点gg、snp365位点位点cc、snp378位点tt和snp396位点aa；表明该5个个体与马氏珠母贝耐低温性状相关，可作为亲本，按照马氏珠母贝常规育苗技术繁育子代。
[0092]
表5 perlucin基因8个snp位点测序结果基因型统计
[0093][0094]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。