一种李属植物的亲子鉴定方法

1.本发明涉及李属植物育种技术领域中，一种李属植物的亲子鉴定方法。


背景技术：

2.仁用杏与扁桃均属于李属植物，但两者亲缘关系较远，杂种优势明显，因此，仁用杏与扁桃间远缘杂交育种是目前获得优良仁用杏新种质的重要手段。同时，由于亲缘关系较远，远缘杂交极难获得杂交后代。为提高杂交效率，采用所谓“连被去雄”方法进行授粉，但因为此方法不进行套袋隔离，为了排除自然授粉的影响，判定已获得的杂种与杂交苗是否真正为仁用杏与扁桃间的远缘杂交后代，有必要对其假定父本进行亲子鉴定分析。随着分子技术的发展，目前用于亲子鉴定的方法主要有微卫星标记(ssr)、snp标记和线粒体标记等分子手段,其中ssr标记技术被认为是开展亲子鉴定的首选。ssr标记具有高度多态性，呈共显性遗传，并且符合孟德尔遗传分离规律，技术操作简单，且可靠性高。已广泛用于人和动物的亲子鉴定，并取得不错的效果。但是，用于植物亲子鉴定的相关研究较少。在杏和扁桃的资源鉴定与遗传育种研究中，微卫星标记已被广泛用于遗传多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析以及遗传连锁图谱构建等方面，但对其在亲子鉴定研究中的应用尚未见报道。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何鉴定杏和扁桃杂交后代的亲本。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组，该引物组由名称分别为udp98-406-p、udp98-409-p、udp98-411-p、udp98-412-p、p04-p、bppct029-p、bppct030-p、bppct039-p、pchcms4-p、pchgms4-p、pacita15-p、pacita7-p、udap422-p、udap404-p和ampa095-p；
5.所述udp98-406-p由名称分别为序列表中序列1和序列2所示的两条单链dna组成；
6.所述udp98-409-p由名称分别为序列表中序列3和序列4所示的两条单链dna组成；
7.所述udp98-411-p由名称分别为序列表中序列5和序列6所示的两条单链dna组成；
8.所述udp98-412-p由名称分别为序列表中序列7和序列8所示的两条单链dna组成；
9.所述p04-p由名称分别为序列表中序列9和序列10所示的两条单链dna组成；
10.所述bppct029-p由名称分别为序列表中序列11和序列12所示的两条单链dna组成；
11.所述bppct030-p由名称分别为序列表中序列13和序列14所示的两条单链dna组成；
12.所述bppct039-p由名称分别为序列表中序列15和序列16所示的两条单链dna组成；
13.所述pchcms4-p由名称分别为序列表中序列17和序列18所示的两条单链dna组成；
14.所述pchgms4-p由名称分别为序列表中序列19和序列20所示的两条单链dna组成；
15.所述pacita15-p由名称分别为序列表中序列21和序列22所示的两条单链dna组成；
16.所述pacita7-p由名称分别为序列表中序列23和序列24所示的两条单链dna组成；
17.所述udap422-p由名称分别为序列表中序列25和序列26所示的两条单链dna组成；
18.所述udap404-p由名称分别为序列表中序列27和序列28所示的两条单链dna组成；
19.所述ampa095-p由名称分别为序列表中序列29和序列30所示的两条单链dna组成。
20.上述引物组中，udp98-406-p、udp98-409-p、bppct039-p和pacita7-p的偶数序列、其它引物对的奇数序列所示引物的5
′
末端标记荧光物质，如hex、fam、hex、或tamra。
21.所述引物组中每条引物的摩尔数均相等。
22.所述引物组的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
23.x1)鉴定或辅助鉴定李属植物亲子关系；
24.x2)制备鉴定或辅助鉴定李属植物亲子关系产品；
25.x3)鉴定或辅助鉴定仁用杏与扁桃杂交后代亲本；
26.x4)制备鉴定或辅助鉴定仁用杏与扁桃杂交后代亲本产品。
27.本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述引物组。
28.所述试剂盒的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
29.x1)鉴定或辅助鉴定李属植物亲子关系；
30.x2)制备鉴定或辅助鉴定李属植物亲子关系产品；
31.x3)鉴定或辅助鉴定仁用杏与扁桃杂交后代亲本；
32.x4)制备鉴定或辅助鉴定仁用杏与扁桃杂交后代亲本产品。
33.本发明还提供了一种鉴定待测李属植物亲本的方法，所述方法包括：分别以待测杂交苗和假定扁桃亲本的基因组dna为模板，利用所述引物组对进行pcr扩增，检测杂交苗和假定扁桃亲本的pcr产物确定待测杂交苗和假定扁桃亲本的15个ssr位点是否符合孟德尔遗传规律，15个ssr位点均符合孟德尔遗传规律的待测杂交苗和假定扁桃亲本具有或候选具有亲子关系；15个ssr位点均不符合孟德尔遗传规律的待测杂交苗和假定扁桃亲本不具有或候选不具有亲子关系；15个ssr位点中部分位点不符合孟德尔遗传规律的待测杂交苗和假定扁桃亲本依据累积rcp值确定二者是否具有亲子关系：累积rcp值＝1-(1-rcp1)(1-rcp2)
……
(1-rcp15)；
34.累积rcp值大于等于99.73％的待测李属植物和假定亲本具有或候选具有亲子关系，累积rcp值小于99.73％的待测李属植物和假定亲本不具有或候选不具有亲子关系；
35.rcp1、rcp2、rcp3、rcp4、rcp5、rcp6、rcp7、rcp8、rcp9、rcp10、rcp11、rcp12、rcp13、rcp14和rcp15分别为udp98-406、udp98-409、udp98-411、udp98-412、p04、bppct029、bppct030、bppct039、pchcms4、pchgms4、pacita15、pacita7、udap422、udap404和ampa095的rcp值；rcp值＝pi/(pi+1)；
36.所述15个ssr位点为udp98-406、udp98-409、udp98-411、udp98-412、p04、bppct029、bppct030、bppct039、pchcms4、pchgms4、pacita15、pacita7、udap422、udap404和ampa095。
37.上述方法中，所述待测杂交苗的母本已知，父本未知。
38.上述方法中，所述待测李属植物可为仁用杏、扁桃或仁用杏与扁桃的杂交后代。
39.所述鉴定待测李属植物亲本的方法在仁用杏与扁桃杂交育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
40.本发明的引物组与方法可以对仁用杏和扁桃及其子代进行亲缘关系识别，建立亲子鉴定体系，操作简单，本发明的引物组与方法可以快速获得李属植物亲本和子代遗传信息并确定子代来源，可以在苗期提早确定并保留真正的仁用杏与扁桃间的杂交子代，这有利于在苗期进行快速判定出真正的远缘杂交苗，从而去除因自然授粉而带来的混杂子代，并在苗期进行剔除，以节约土地资源，并可减少后期鉴定成本，加快育种进程，亦可为其他果树植物亲子鉴定提供参考。
41.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
42.图1为6份材料ssr聚类分析树状图。
具体实施方式
43.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna的3
′
末端核苷酸。
44.下述实施例中的假定父本1号(af1)是扁桃品种
‘
monterey(蒙特瑞)’，由山东省果树研究所提供，记载在“引进的几个美国扁桃品种简介，陈修会等，西南园艺，第30卷2002年第4期”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
45.下述实施例中的假定父本2号(af2)是扁桃品种
‘
thompson(辛普森)’，由山东省果树研究所提供，记载在“引进的几个美国扁桃品种简介，陈修会等，西南园艺，第30卷2002年第4期”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
46.实施例1、用于李属植物亲子鉴定的引物组的制备
47.本实施例提供了一组用于李属植物亲子鉴定的引物组，该引物组中各个引物的信息见表1，该引物组中每条引物的摩尔数均相等，udp98-406-p、udp98-409-p、bppct039-p和pacita7-p的反向引物(r)、其它引物对的正向引物(f)5
′
末端标记荧光物质。
48.表1、ssr引物序列信息
[0049][0050][0051]
实施例2、实施例1的引物组在李属植物亲子鉴定中的应用
[0052]
待测样本：2个假定父本扁桃
‘
monterey’(编号af1)和
‘
thompson’(编号af2)的叶片，母本
‘
龙王帽’(编号m)仁用杏的叶片，3株远缘杂交苗(编号为a1、b1和b2)的叶片。
[0053]
1、基因组dna提取
[0054]
采用ctab法提各待测样本叶片基因组dna，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行dna质量检测，用k5800超微量分光光度计进行浓度检测。
[0055]
2、pcr扩增及产物检测
[0056]
采用10μl反应体系：10
×
buffer i 1μl，2.5mm dntp 0.8μl，实施例1的引物组0.8μl，hs taq(5u/μl)0.1μl，待测样本基因组dna 1.0μl，ddh2o补齐至10μl。该体系中，实施例1中引物组各引物的浓度均为0.4μm。10
×
buffer i为北京阅微基因技术股份有限公司产品，货号：202105；hs taq(5u/μl)为takar公司产品，货号：al52290a。
[0057]
pcr反应条件为：95℃预变性5min，之后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后60℃延伸30min。
[0058]
采用毛细管电泳检测，具体如下：96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μl，pcr产物1.0μl；95℃变性3min，之后用abi3730基因分析仪进行毛细管电泳检测。
[0059]
3、数据分析和处理
[0060]
将检测得到的原始数据文件导入到分析软件genemapper id3.2中进行实验结果统计，对电泳检测结果进行个体基因型分型分析，运用cervus3.0软件分析等位基因数和等位基因频率以及多态信息含量(pic)。
[0061]
通过对6份材料的测序检测分析，结果显示15个ssr位点共检测到78个等位基因，平均每个位点有5.2个等位基因，高于进行亲子鉴定微卫星位点等位基因数至少为4的要求。检测出等位基因数量最多的位点是udp98-411和bppct039，分别有7个等位基因，基因座检测出等位基因数量最少的也有4个等位基因(表2和表3)。这15个位点的多态性较高，pic均值为0.679，除pchgms4(0.5＞pic＝0.393＞0.25)为中度多态性位点外，其它14个位点的pic值均大于0.5，为高度多态性位点(表3)。
[0062]
表2、6份样本中15个ssr位点等位基因频率的分布
[0063][0064]
表3、多态信息含量
[0065]
ssr位点等位基因数目多态信息量ssr位点等位基因数目多态信息量udp98-40640.599pchcms440.599udp98-40950.726pchgms440.393udp98-41170.782pacita1560.719udp98-41260.777pacita760.777
p0450.726udap42250.643bppct02960.719udap40440.622bppct03040.622ampa09550.692bppct03970.782
ꢀꢀꢀ
[0066]
4、亲子关系判定
[0067]
通过基因分型和计算累积rcp值来来鉴定亲子关系。母本确定，父本不详时的亲子鉴定一般采用标准三联体法(假设父-子-母)对假定亲本和子代进行分型和计算适用公式的确定。即将所有ssr位点的扩增结果根据两个亲本和子代基因座等位基因类型进行分组，每组采用相应的亲权指数(pi)计算公式。亲权指数(pi)的计算公式参考杨庆恩(1998)和陆惠玲等(2001)的给出的pi简化计算方法，见表4。
[0068]
父权相对关系机率rcp＝pi/(pi+1)。
[0069]
表4、标准三联体ssr基因组对应pi简化计算公式
[0070][0071]
注：p、q、r、s表示每个基因座(ssr)位点的不同等位基因；p和q为真正父本基因频率。下同。
[0072]
亲子关系鉴定方法的可靠性验证：基于ssr位点分型数据，对亲本和子代材料进行upgma聚类分型。
[0073]
6份试验材料用15对引物进行扩增检测和测序分析结果见表5。通过对ssr分型结果分析，子代a1及其已知母本(m)
‘
龙王帽’和假定父本(af1)
‘
monterey’符合孟德尔遗传规律，假定父本(af1)
‘
monterey’与a1具有亲缘关系；而子代b2及其已知母本(m)
‘
龙王帽’和假定父本(af2)
‘
thompson’的基因遗传违反孟德尔遗传规律，15个位点中子代b2均未出现假定父本(af2)
‘
thompson’的等位基因，因此可排除它们之间有亲缘关系。子代b1与其已知母本
‘
龙王帽’和假定父本(af2)
‘
thompson’有12个位点的分离符合孟德尔遗传规律，有3个位点违反孟德尔遗传规律，假定父本(af2)
‘
thompson’与b1是否有亲缘关系，还有待于通过进一步的亲权指数分析来证实。
[0074]
表5、杏与扁桃远缘杂交亲本和后代15个ssr位点的分型
[0075][0076]
对符合孟德尔遗传规律的两对可能存在
‘
父子’亲缘关系的样本进行进一步的亲权指数分析。根据母
‑‑
子对或父
‑‑
子对的dna分型图比对，可确定母亲传给孩子的必需基因以及生父基因。15个ssr位点的扩增结果根据亲本和子代a1基因座等位基因类型分为9组(表5)，udp98-406和bppct039为一组，udp98-409、bppct030和udap422为一组，udp98-411、udp98-412、pacita15和pacita7为一组，其它6个位点各成一组，每组采用相应的pi值计算公式。杏与扁桃远缘杂交后代的亲子鉴定类型及pi值计算参考表2和表5。用多个位点进行亲子鉴定时，一般采用累积rcp值进行判定。由表6可知，子代a1通过15个ssr位点的累积rcp＝1-(1-rcp1)(1-rcp2)
……
(1-rcp15)＝99.999998％，由此可判断远缘杂交后代a1是来源于父本
‘
monterey’。按照国内外亲子鉴定的惯例，当rcp值大于99.73％时，则可以认为假设父本与杂种具有亲子关系。
[0077]
表6、杏与扁桃远缘杂后代15个ssr位点分型结果分析
[0078][0079]
基于ssr数据，对6份材料行upgma聚类分析，结果如图1所示，6个样本在遗传相似系数0.525处分为两组(ⅰ和ⅱ)，b2与其它样本间的亲缘关系较远，单独形成一个组ⅰ，其它品种形成一个组ⅱ。在遗传相似系数0.79处，组ⅱ中af1(
‘
monterey’)与a1聚在一组，关系最近；af2(
‘
thompson’)与b1和m(
‘
龙王帽’)虽然关系相对相对较远，但也在0.525处与这两个样本聚在一个组内。此聚类结果表明af1(
‘
monterey’)与子代a1间亲缘关系较近，af2(
‘
thompson’)与子代b1亲缘关系相对较近，而与子代b2亲缘关系最远，与前面的亲权关系鉴定结果相一致。
[0080]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。