一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法与流程

1.本发明属于水凝胶技术领域，具体涉及一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.水凝胶是由亲水性单体通过物理或化学交联的方式形成的一类具有三维网状结构的材料。由于水凝胶具有良好的生物相容性和柔性，其可以应用于组织工程，药物输送和伤口敷料等领域。具有粘附性能的水凝胶能够在组织表面实现伤口封闭，从而实现止血的目的，但大多数粘附水凝胶存在力学性能差、易损坏的缺点。此外，用于伤口敷料的水凝胶还应具有良好的抗菌性能以防止伤口感染。因此，急需开发出兼具优异的粘附性能、自修复、良好生物相容性、抗菌、以及止血性能的水凝胶材料。
3.天然多糖因其具有良好的亲水性，优异的生物降解性、良好的生物活性以及高的生物相容性等，被广泛用于制作生物医用水凝胶。然而，基于天然多糖的水凝胶均不能同时实现反复粘附、自修复、抗菌和止血性能，繁琐的制备和化学修饰过程也极大地影响了水凝胶的生物相容性，使得它们在生物医用领域中的应用受到很大限制。因此，制备兼具优异的粘附性能、自修复、抗菌和止血性能，同时具有优异生物相容性的天然多糖水凝胶仍然存在挑战。


技术实现要素：

4.针对现有技术的缺陷，本发明提供一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，通过将天然多糖、多酚类物质、粘土在碱性条件下进行复合，制备得到的水凝胶，能克服现有技术中水凝胶不能兼具优异的粘附性能、自修复、生物相容性、抗菌和止血性能的缺陷。
5.一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：在搅拌状态下，将多酚类物质、天然多糖加入粘土水溶液中，将体系的ph值调节至8-9，形成天然多糖-粘土水溶液；（2）制备水凝胶：向所述天然多糖-粘土水溶液中加入单体、引发剂和交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在10-40℃下反应10-60min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶；其中，所述天然多糖为海藻酸钠、果胶、纤维素中的至少一种和壳聚糖。
6.优选地，所述多酚类物质为木质素、单宁酸中的至少一种。
7.优选地，所述粘土为硅酸镁锂、硅酸镁铝、高岭土、蒙脱土或水滑石中的任意一种。
8.优选地，所述单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯的至少一种。
9.优选地，所述天然多糖为粘土质量的10-200%，所述多酚类物质为粘土质量的20-200%。
10.优选地，所述粘土水溶液的浓度为1-3wt%。
11.优选地，所述粘土为单体质量的1-10%。
12.优选地，所述引发剂为单体质量的1-3%，交联剂为单体质量的0.1-0.3%。
13.优选地，所述天然多糖中海藻酸钠、果胶、纤维素中的至少一种与壳聚糖的质量比为5：（2.5-20）。
14.优选地，所述引发剂为过硫酸铵与四甲基乙二胺的混合物；所述交联剂为n,n-亚甲基双丙烯酰胺。
15.优选地，步骤（1）中采用naoh溶液将体系的ph值调节至8-9。
16.本发明的优点：（1）在本发明中，天然多糖、多酚类物质以及粘土在碱性条件下进行复合，通过多酚类物质与天然多糖之间发生迈克尔加成以及天然多糖-多酚类物质-粘土之间的多重非共价相互作用，包括氢键、静电相互作用等，增强了水凝胶的力学性能。
17.（2）本发明采用一步法制备水凝胶，过程简单易操作，制备得到含天然多糖的止血水凝胶具有优异的自修复和粘附性能。
18.（3）此外，水凝胶还具有优异的生物相容性以及良好的抗菌性能，凝胶浸提液与细胞共培养24 h后的细胞存活率高，水凝胶对大肠杆菌的杀菌效率高。
19.（4）水凝胶还具有优异的止血性能，与空白对照组相比，水凝胶的出血量和出血时间明显降低。
附图说明
20.图1 是实施例1制备的水凝胶的力学性能测试图；图2是实施例1制备的水凝胶的粘附性能测试图；图3是实施例1制备的水凝胶的自修复性能测试图；图4 是实施例1制备的水凝胶的细胞毒性图；图5 是实施例1制备的水凝胶的抗菌性能图；图6 是实施例1制备的水凝胶的止血性能图。
具体实施方式
21.实施例1一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将62.5mg硅酸镁锂溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁锂水溶液；在搅拌状态下，将120mg木质素、80mg壳聚糖、45mg海藻酸钠依次加入所述硅酸镁锂水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为黑色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.25g丙烯酰胺单体、25mg过硫酸铵和26μl（20.02 μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.9mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在25℃下反应30min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为黑色的水凝胶。
22.实施例2一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将125mg硅酸镁铝溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁铝水溶液；在搅拌状态下，将110mg木质素、125mg壳聚糖、100mg纤维素依次加入所述硅酸
镁铝水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为黑色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.25g甲基丙烯酰胺单体、12.5mg过硫酸铵和16.1 μl（12.86μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.25mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在30℃下反应40min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为黑色的水凝胶。
23.实施例3一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将125mg高岭土溶于5ml去离子水中，得到高岭土水溶液；在搅拌状态下，将120mg木质素、125mg壳聚糖、100mg果胶依次加入所述高岭土水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为黑色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.25g甲基丙烯酸羟乙酯单体、37.5mg过硫酸铵和48μl（36.96μg）四甲基乙二胺作为引发剂、3.75mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在20℃下反应20min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为黑色的水凝胶。
24.实施例4一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将50mg蒙脱土溶于5ml去离子水中，得到蒙脱土水溶液；在搅拌状态下，将100mg单宁酸、25mg壳聚糖、25mg海藻酸钠、25mg纤维素依次加入所述蒙脱土水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入0.5g甲基丙烯酸羟乙酯单体、5mg过硫酸铵和6.4μl（4.93μg）四甲基乙二胺作为引发剂、0.5mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在40℃下反应50min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
25.实施例5一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将50mg水滑石溶于5ml去离子水中，得到水滑石水溶液；在搅拌状态下，将50mg单宁酸、50mg壳聚糖、50mg海藻酸钠依次加入所述水滑石水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入0.5g丙烯酰胺单体、10mg过硫酸铵和12.8μl（9.86μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在40℃下反应60min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
26.实施例6一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将50mg蒙脱土溶于5ml去离子水中，得到蒙脱土水溶液；在搅拌状态下，将20mg单宁酸、30mg壳聚糖、10mg海藻酸钠依次加入所述蒙脱土水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；
（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入0.5g甲基丙烯酰胺单体、15mg过硫酸铵和19.2 μl（14.78μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.5mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在10℃下反应20min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
27.实施例7一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将50mg水滑石溶于5ml去离子水中，得到水滑石水溶液；在搅拌状态下，将10mg单宁酸、4mg壳聚糖、1mg果胶依次加入所述水滑石水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入0.5g甲基丙烯酸羟乙酯单体、5mg过硫酸铵和6.4μl（4.93μg）四甲基乙二胺作为引发剂、0.5mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在20℃下反应10min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
28.实施例8一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将150mg高岭土溶于5ml去离子水中，得到高岭土水溶液；在搅拌状态下，将175mg单宁酸、150mg壳聚糖、100mg纤维素依次加入所述高岭土水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.75g甲基丙烯酰胺单体、52.5mg过硫酸铵和67.7μl（52.13μg）四甲基乙二胺作为引发剂、5.25mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在30℃下反应60min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
29.实施例9一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将150mg硅酸镁铝溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁铝水溶液；在搅拌状态下，将50mg单宁酸、75mg壳聚糖、125mg果胶依次加入所述硅酸镁铝水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.75g甲基丙烯酰胺单体、35mg过硫酸铵和45.1μl（34.73μg）四甲基乙二胺作为引发剂、3.5mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在40℃下反应30min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
30.实施例10一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将150mg硅酸镁锂溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁锂水溶液；在搅拌状态下，将75mg木质素、150mg单宁酸、75mg壳聚糖、150mg海藻酸钠依次加入所述硅酸镁锂水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至9，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.75g丙烯酰胺单体、17.5mg过硫酸铵和22.6μl（17.4μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.75mg n,n-亚甲基双丙
烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在10℃下反应50min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
31.对比例1一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将62.5mg硅酸镁锂溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁锂水溶液；在搅拌状态下，将120mg木质素、80mg壳聚糖、45mg海藻酸钠依次加入所述硅酸镁锂水溶液中，搅拌，得到天然多糖-粘土水溶液，为黑色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.25g丙烯酰胺单体、25mg过硫酸铵和26 μl（20.02 μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.9mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在25℃下反应30min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为黑色的水凝胶。
32.对比例2一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将62.5mg硅酸镁锂溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁锂水溶液；在搅拌状态下，将80mg壳聚糖、45mg海藻酸钠依次加入所述硅酸镁锂水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为淡黄色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.25g丙烯酰胺单体、25mg过硫酸铵和26 μl（20.02 μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.9mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在25℃下反应30min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为淡黄色的水凝胶。
33.对比例3一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将62.5mg硅酸镁锂溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁锂水溶液；在搅拌状态下，将120mg木质素、80mg壳聚糖依次加入所述硅酸镁锂水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为黑色混合溶液；（2）制备水凝胶：向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.25g丙烯酰胺单体、25mg过硫酸铵和26 μl（20.02 μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.9mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在25℃下反应30min，即得到所述含天然多糖的止血水凝胶，为黑色的水凝胶。
34.对比例4一种含天然多糖的止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：（1）制备天然多糖-粘土水溶液：将62.5mg硅酸镁锂溶于5ml去离子水中，得到硅酸镁锂水溶液；在搅拌状态下，将120mg木质素、45mg海藻酸钠依次加入所述硅酸镁锂水溶液中，用naoh溶液调节体系的ph至8.5，得到天然多糖-粘土水溶液，为黑色混合溶液；（2）向步骤（1）得到的天然多糖-粘土水溶液中加入1.25g丙烯酰胺单体、25mg过硫酸铵和26 μl（20.02 μg）四甲基乙二胺作为引发剂、1.9mg n,n-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，形成混合溶液，搅拌均匀后，在25℃下反应30min，无法成胶。
35.性能检测一. 力学性能检测
检测实施例1中水凝胶的拉伸和压缩性能检测，见图1。
36.对于拉伸实验：水凝胶的拉伸性能在25℃下以50 mm/min的拉伸速度通过拉伸仪进行单轴拉伸测量，见图1中（a）。由图1中（a）可知，水凝胶样品具有出色的拉伸性能，其断裂应变达到1382％，计算得到：杨氏模量为2.94 kpa，韧性为103.6 kj/m3；同时，检测对比例1-3的水凝胶的拉伸性能，计算其断裂应变，结果见表1。其中，对比例4未形成凝胶，故其力学性能未在表中呈现。
37.对于压缩实验：将水凝胶在室温下以5 mm/min的压缩速度通过拉伸仪进行循环压缩测量，检测其压缩性能，见图1（b）所示。由图1中（b）可知，水凝胶被压缩至初始应变的80%，在撤去压力后可恢复到初始状态，可见其可以承受较大的压缩力并迅速恢复至初始状态。
38.二. 粘附性能测试将实施例1得到的水凝胶，做粘附性能测试。剪切粘附强度的测试以30 mm/min的拉伸速度使凝胶从两片基材之间剥离，记录剥离过程中的最大力，剪切粘附强度的计算是通过最大的力除以两片基材之间的重叠面积。如图2所示，随着粘附时间的延长，水凝胶的粘附强度明显增强，当粘附时间从1 h增加到7 h时，水凝胶在不锈钢表面上的粘附强度从16 kpa提高到78 kpa，表明水凝胶在不锈钢上具有良好的粘附性能；同时，检测对比例1-3的水凝胶的粘附强度，结果见表1，其中，其粘附强度是基于粘附时间为7h时得到的；其中，对比例4未形成凝胶，故其粘附强度未在表中呈现。
39.表1 断裂应变和粘附强度三. 拉伸自修复性能测试检测实施例1得到的水凝胶的自修复性能测试。将水凝胶制备成圆柱形样品进行自修复性能测试，拉伸速度为50 mm/min，分别取不同自修复时间的样品进行实验。自修复效率为自愈合后水凝胶样品的拉伸应力-应变曲线的断裂应力与原始样品的拉伸应力-应变曲线的断裂应力之比，见图3。由图3可知，当自愈合时间从1 h增加到24 h时，自愈合效率从35.7%增加到102.5%，表明本发明制备的水凝胶具有优异的自愈合性能。
40.四、细胞毒性测试将实施例1得到的水凝胶，做细胞毒性测试。在细胞毒性测试研究中，水凝胶在37oc下浸泡在dmem中24 h，以获得水凝胶提取液；将不同浓度的水凝胶提取液与细胞共培养24 h；使用mtt法，用spectra max 190酶标仪对溶液的光密度(od)进行定量测试，计算细胞活性(cell viability)，cell viability (%) = [od]
tested
/[od]
control
×ꢀ
100，结果如图
4所示。由图4可知，实施例1所得水凝胶的浸提液浓度高达75%时，水凝胶的细胞存活率也保持在85%左右，表明水凝胶具有优异的生物相容性。
[0041]
五、抗菌性能测试将实施例1得到的水凝胶，做抗菌性能测试。在抗菌性能测试研究中，用大肠杆菌表征凝胶的抗菌性能。首先，将菌液与经过灭菌处理后的水凝胶在霉菌培养箱中培养4 h，然后，取8 μl凝胶与细菌共培养液均匀涂布在lb琼脂培养板上，并在37℃的霉菌培养箱中培养18 h，计算菌落数。杀菌率的计算公式如下：kill%=（对照样品平均菌落数-样品平均菌落数）/对照样品平均菌落数
ⅹ
100%。其中，未加水凝胶的样品作为对照组。如图5所示，水凝胶的杀菌率可达86%，表明水凝胶具有优异的抗菌性能。
[0042]
六、止血性能测试将实施例1得到的水凝胶，做止血性能测试。在止血性能测试研究中，采用大鼠(正常标准大鼠，160-180 g)出血肝脏模型。首先，将麻醉后的老鼠腹部切口并暴露出肝脏。然后，用针头诱导肝脏出血，并立即将凝胶敷在出血部位，记录出血时间和出血量。以不做任何止血处理的老鼠作为空白对照，同时，以采用纱布止血的老鼠作为对比例，结果如图6所示。可知，实施例1水凝胶的出血量和止血时间分别为43 mg和24 s，与空白对照组相比，实施例1水凝胶的出血量和出血时间分别降低了74.3%和84.7%；与采用纱布止血的老鼠相比，也具有明显较快的止血效果。以上结果表明，实施例1水凝胶具有良好的活体止血能力。