基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用

本发明属于生物，具体涉及基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用。

背景技术：

1、类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei)简称为类鼻疽菌，由于具有侵入和在细胞内存活的能力而对人类致病，主要引起类鼻疽(melioidosis)，曾在东南亚和澳大利亚北部地区流行，可通过皮肤接触、吸入或食入等途径发生感染。类鼻疽患者病死率高，临床表现为多发性脓肿、难治性肺炎及致死性败血症，严重的败血症性类鼻疽在24～48小时内就可导致患者死亡，世界范围内类鼻疽病例逐年的增加使之成为一项严重的公共卫生问题。

2、针对类鼻疽菌开发出特异、快速、灵敏的检测方法对类鼻疽防治，挽救患者生命具有积极作用。针对环境中类鼻疽菌检测的“金标准”是基于土壤和水体的微生物分离培养，而在临床中对类鼻疽的检测则是血液培养分离鉴定，但这些方法耗时耗力且需要专业人员操作。目前，分子鉴定如聚合酶链式反应技术(pcr)已成为病原细菌检测的常规技术方法。然而，类鼻疽菌与同属的姊妹物种(如鼻疽伯克霍尔德菌)有很大的相似性，因此很难鉴别。也有一些关于采用染色体上的特异序列来区分这两种菌，但实验室采用的菌株数目太少，引物特异性验证有限。

3、随着高通量测序技术的快速发展，使得短时间内能够获得大量类鼻疽相关基因组数据。这些海量数据使得通过生物信息学分析方法获得类鼻疽菌的核心基因组特异序列标签成为可能，与新兴的rpa-crispr快速检测技术结合可快速准确的对类鼻疽菌和类鼻疽病进行鉴定与诊断，目前在国内外还未见报道。

4、鉴于目前的检测方法仍不能满足临床检测的需求，敏感性和特异性还有待进一步提高，因此开发一种快速便捷、特异性好，灵敏度高的类鼻疽菌的检测方法能够为类鼻疽病的防控提供可靠、有效的技术保障。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何快速、特异和/或灵敏地检测类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异序列标签，所述特异序列标签可为lc1和/或lc2，所述lc1可为核苷酸序列为seq id no.1的dna，所述lc2可为核苷酸序列为seq id no.2的dna。

3、所述特异序列标签为本发明鉴定筛选得到的含有pam序列(tttn)的类鼻疽菌2条染色体上的特异序列标签，分别命名为lc1和lc2，lc1和lc2是能够用来检测类鼻疽菌存在和能区分其与其他病原菌的特异性核酸序列。

4、类鼻疽菌两条染色体，一条大染色体，与细菌基本的营养代谢活动相关；一条小染色体，与细菌的耐药、毒力和环境适应性相关。

5、本发明还提供了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有由引物lc1-f2和引物lc1-r3组成的引物对、lc1-crrna-1和ssdna reporter，或含有由引物lc2-f4和引物lc2-r4组成的引物对、lc2-crrna-2和ssdna reporter，或含有由引物lc1-f2、引物lc1-r3、引物lc2-f4和引物lc2-r4组成的引物组合物、lc1-crrna-1、lc2-crrna-2和ssdna reporter；所述引物lc1-f2为seq id no.4所示的单链dna分子；所述引物lc1-r3为seq id no.9所示的单链dna分子；所述引物lc2-f4为seq id no.14所示的单链dna分子；所述引物lc2-r4为seq id no.18所示的单链dna分子；所述lc1-crrna-1为seq idno.19所示的rna分子，所述lc2-crrna-2为seq id no.22所示的rna分子。

6、seq id no.19的第1-21位为用于与cas12a蛋白结合的锚定序列，seq id no.19的第22-45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签lc1，seq id no.1)的向导序列，用于结合rpa引物对(引物lc1-f2和引物lc1-r3)的扩增产物。

7、seq id no.22的第1-21位为用于与cas12a蛋白结合的锚定序列，seq id no.22的第22-45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签lc2，seq id no.2)的向导序列，用于结合rpa引物对(引物lc2-f4和引物lc2-r4)的扩增产物。

8、进一步地，所述ssdna reporter的核苷酸序列可如seq id no.23所示。

9、所述ssdna reporter为报告dna，所述报告dna为具有信号报告功能的dna分子，当所述dna分子被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。所述阳性信号可为荧光信号。在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddh2o)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。

10、所述报告dna可为单链dna(ssdna)。

11、在本发明的一个实施方案中，所述ssdna的核苷酸序列可为：

12、fam-cccccccccccc-bhq1(seq id no.23)，由上海生工生物有限公司合成。

13、进一步地，所述试剂或试剂盒还可包括cas12a蛋白。

14、进一步地，所述cas12a蛋白可独立存在或与本发明所述的crrna以复合物的形式存在。

15、进一步地，所述cas12a蛋白可为lbcas12a蛋白。

16、所述引物lc1-f2和lc2-f4为正向引物(上游引物)，所述引物lc1-r3和lc2-r4为反向引物(下游引物)。

17、所述正向引物lc1-f2(seq id no.4)和反向引物lc1-r3(seq id no.9)为特异性扩增特异序列标签lc1(seq id no.1)的引物对，即用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异引物对。

18、所述正向引物lc2-f4(seq id no.14)和反向引物lc2-r4(seq id no.18)为特异性扩增特异序列标签lc2(seq id no.2)的引物对，即用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异引物对。

19、进一步地，所述试剂或试剂盒还可包括阳性对照模板，所述阳性对照模板可为携带(含有)特异序列标签lc1和/或特异序列标签lc2的重组载体，所述特异序列标签lc1的核苷酸序列为seq id no.1，所述特异序列标签lc2的核苷酸序列为seq id no.2。

20、进一步地，所述阳性对照模板可为质粒peasy-t1-lc1和/或peasy-t1-lc2，其中质粒peasy-t1-lc1含有seq id no.1所示的dna分子，质粒peasy-t1-lc2含有seq id no.2所示的dna分子。

21、进一步地，所述试剂或试剂盒还可包括阴性对照模板，所述阴性对照模板可为去离子水。

22、所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

23、进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、cd等)。

24、本发明还提供了本文中任一所述引物对，和/或，本文中任一所述crrna的下述任一种应用：

25、d1)在检测类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；

26、d2)在检测特异序列标签lc1和/或lc2或制备用于检测特异序列标签lc1和/或lc2的产品中的应用；

27、d3)在鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；

28、d4)在制备用于诊断或辅助诊断类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；

29、d5)在筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病或制备筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；

30、d6)在鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌的产品中的应用；

31、d7)在类鼻疽防控中的应用。

32、本发明还提供了所述特异序列标签的下述任一种应用：

33、e1)在检测类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；

34、e2)在鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌或制备用于鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用；

35、e3)在制备用于诊断或辅助诊断类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；

36、e4)在筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病或制备筛查类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病的产品中的应用；

37、e5)在鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分类鼻疽伯克霍尔德菌和其他病原菌的产品中的应用；

38、e6)在类鼻疽防控中的应用。

39、本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。

40、本文所述其他病原菌可为鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia mallei)、羊布鲁氏菌(brucella melitensis)、牛布鲁氏菌(brucella abortus)、猪布鲁氏菌(brucellasuis)、犬布鲁氏菌(brucella canis)、土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)和/或伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)。

41、本文所述类鼻疽伯克霍尔德菌引起的疾病可为类鼻疽(melioidosis)。

42、本发明还提供了检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法，所述方法可包括使用所述试剂或试剂盒对待测样品进行重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)反应(rpa扩增反应)和crispr/cas12a检测，根据检测结果确定待测样品中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌或待测样品是否为类鼻疽伯克霍尔德菌，所述方法的目的为非疾病诊断目的。

43、进一步地，所述rpa扩增反应可为实时荧光rpa反应。

44、进一步地，上述方法中，所述rpa扩增反应的体系可包括下述任一种：

45、m1)引物lc1-f2、引物lc1-r3、primer free rehydration buffer、去离子h2o、mgoac溶液和dna模板；

46、m2)引物lc2-f4、引物lc2-r4、primer free rehydration buffer、去离子h2o、mgoac溶液和dna模板。

47、进一步地，上述方法中，所述rpa扩增反应的条件可为：39℃，扩增30min(1800s)。

48、进一步地，针对m1)所述rpa扩增反应的体系，crispr/cas12a检测的体系可包括：lbcas12a、ssdna、rna酶抑制剂、buffer(neb)、lc1-crrna-1和去离子h2o；针对m2)所述rpa扩增反应的体系，crispr/cas12a检测的体系可包括：lbcas12a、ssdna、rna酶抑制剂、buffer(neb)、lc2-crrna-2和去离子h2o。

49、进一步地，所述crispr/cas12a检测的条件可为：37℃，10min(600s)。

50、在本发明的一个实施方案中，所述rpa扩增反应的体系(50μl)为：引物lc1-f2(10μmol/l)2.4μl；引物lc1-r3(10μmol/l)2.4μl；primer free rehydration buffer29.5μl；去离子h2o 10.7μl；mgoac溶液3μl；dna模板2μl。

51、在本发明的一个实施方案中，所述rpa扩增反应的体系(50μl)为：引物lc2-f4(10μmol/l)2.4μl；引物lc2-r4(10μmol/l)2.4μl；primer free rehydration buffer29.5μl；去离子h2o 10.7μl；mgoac溶液3μl；dna模板2μl。

52、在本发明的crispr实施方案中，所述crispr/cas12a反应体系(40μl)为：lbcas12a(75nm)0.3μl；ssdna(500nm)2μl；rna酶抑制剂0.5μl；buffer(neb)3μl；lc1-crrna-1(500nm)10μl；去离子h2o 4.2μl；rpa产物20μl。

53、上述方法中，根据检测结果确定待测样品中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌(类鼻疽菌)或待测样品是否为类鼻疽伯克霍尔德菌的方法可为：

54、在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(去离子h2o)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。

55、根据阳性信号的有无判定待测样品中是否含有类鼻疽菌或是否为类鼻疽菌，和/或，根据阳性信号的强弱判定待测样品中类鼻疽菌的浓度：

56、如果有阳性信号，则判定待测样品中含有或者候选含有类鼻疽菌或为类鼻疽菌；如果无阳性信号，则判定待测样品中不含有或者候选不含有类鼻疽菌或不为类鼻疽菌；

57、阳性信号越强，表示待测样品中含有的类鼻疽菌含量越高；阳性信号越弱，表示待测样品中含有的类鼻疽菌含量越低。

58、进一步地，所述待测样品可为血液样品、组织样品、环境样品(如土壤、水或空气)等。

59、上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

60、本发明中所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌可为鉴定或辅助鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌。

61、本文所述任一引物对或引物组合物也在本发明的保护范围内。

62、本文所述lc1-crrna-1和/或lc2-crrna-2也在本发明的保护范围内。

63、本发明首先利用生物信息学分析方法鉴定、筛选获得类鼻疽菌的核心基因组特异序列标签lc1和lc2，并以此为基础设计相应的引物、探针和crrna，结合rpa-crispr/cas12a检测方法构建了两种基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌检测方法(lc1-rpa-crispr/cas12a检测方法和lc2-rpa-crispr/cas12a检测方法)，并开发了相关试剂盒。本发明用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物对、组合物、试剂、试剂盒及其检测方法具有快速便捷、特异性好，灵敏度高的特点，可快速准确的对类鼻疽菌和类鼻疽病进行鉴定与诊断，为类鼻疽病的防控提供可靠、有效的技术保障。