基于纳米孔测序仪的靶向扩增引物、扩增建库方法及应用与流程

1.本发明涉及长读长测序领域，特别涉及一种基于纳米孔测序仪的靶向扩增 引物、扩增建库方法及应用。


背景技术：

2.纳米孔测序技术依赖于一个纳米级的蛋白质孔，纳米孔作为一个生物传感 器被嵌入在一个由一组连接到传感器芯片上的微支架支撑的耐电聚合物膜中， 易位过程中离子电流的变化与传感区域中存在的核苷酸序列相对应，从而能够 对其进行解码，允许对单个分子进行实时测序。纳米孔测序技术正在被大量应 用于基因组组装、全长转录本测序和核苷酸突变检测，以及快速临床诊断和疫 情监测等领域。
3.现有纳米孔测序接头连接方式分为快速法测序接头连接和连接法测序接头 连接，快速法接头连接基于转座酶将待测dna分子或rna分子与纳米孔测序专 用接头连接上，然后加载到测序芯片中进行纳米孔测序。连接法接头连接基于 t4连接酶将待测dna分子或dna-rna杂交分子与纳米孔测序专用接头连接上 (或将待测dna分子或dna-rna杂交分子先与分子标签连接，再与纳米孔测序 专用接头连接上实现多样本测序)，形成待测双链核酸分子
‑‑‑‑
分子标签
‑‑‑‑ꢀ
测序接头复合体，最后加载到测序芯片中进行纳米孔测序。然而快速法的接头 连接方式接头效率低下，在处理高通量样本测序时很难获得足够深度的测序数 据；连接法测序接头连接方式进行t/a接头连接，接头连接效率更高，且在处 理多样本高通量建库时需要引入分子标签，导致建库时需要更多的试剂成本和 时间成本。
4.目前引入分子标签的方式有以下几种：
5.1.如图1所示，在对低浓度核酸样本靶向扩增产物时，第一轮进行靶向扩 增并纯化去除引物干扰，第二轮扩增时将分子标签与第一轮扩增含有引 物序列退火相结合形成引物池二次扩增，接着将样本pooling并末端修 复，最后与连接法测序接头进行连接测序。
6.2.在对高浓度核酸样本靶向扩增产物时，如图2所示，将待测序核酸进行 末端修复纯化，然后与分子标签接头通过t/a连接，再以分子标签为引 物进行扩增并纯化，接着将样本pooling并末端修复，最后与连接法测 序接头进行连接测序。
7.3.在对高浓度核酸样本靶向扩增产物时，如图2所示，将待测序核酸进行 末端修复纯化，然后与分子标签的接头通过t/a连接，接着将样本 pooling并与多样本测序接头进行连接测序。
8.然而以上提到的接头连接方式均存在效率低下、分子标签引入容易造成污 染、建库时间长等问题，无法很好地满足快速高通量的测序需求。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的长片段靶向扩增引物、扩 增建库方法及应用，靶向扩增引物设计简单，扩增和建库过程简单易懂，且为 纳米孔测序仪提供了一整套简单经济的分子标签引物设计方法和后续调整的建 库方案，设计的分子标签
能直接被测序仪识别，具有广泛的应用价值。
10.为实现以上目的，第一方面，本技术方案提供了一种基于纳米孔测序仪的 靶向扩增引物，由依次排序的定位序列、分子标签序列和扩增引物序列组成。
11.在一些实施例中，扩增引物为16s基因通用引物，覆盖16srdna基因全长。
12.16s序列是所有细菌共有的基因，本方案针对细菌序列的16s基因在保守区 设计扩增引物，进而使得该靶向扩增引物可适用于各类的细菌。
13.在一些实施例中，分子标签序列选自96种通用的分子标签序列的一种或者 多种。
14.本方案将96种分子标签加到16s扩增引物上，形成了96个带分子标签的 靶向扩增引物，能同时对96个样品进行扩增，然后混样进行建库测序。
15.在一些实施例中，分子标签序列的3’端接在扩增引物的5’端，分子标签 序列的5’端连接定位序列。
16.如图4和图5所示，本技术方案提供一种基于纳米孔测序仪的靶向扩增引 物的扩增建库方法，包括以下步骤：
17.针对待测序序列设计至少一靶向扩增引物，其中每一所述靶向扩增引物为 定位序列、分子标签序列和扩增引物序列的组合序列；
18.将靶向扩增引物和待测序序列混合进行靶向扩增，得到扩增产物；
19.对所述扩增产物进行末端修复后连接接头。
20.值得一提的是，由于本方案独特设计的靶向扩增引物，直接将分子标签序 列加在扩增引物的末段，进而使得靶向扩增结束后可以直接混样扩增产物进行 单样本建库，只需进行一管末端修复即可，以此方式省去了多样本建库过程中 分子标签和连接酶的使用，大大节约了试剂成本。不仅如此，在pcr扩增结束 后就将所有产物合并成单个文库，后续的建库过程只需对单个文库进行末端修 复，而不必对每个样品进行末端修复，同时省去了额外的分子标签连接步骤， 大大降低了实验的复杂程度，缩短了实验时间，特别是对大量样本同时建库时 尤为明显。
21.传统方式进行多样本建库在末端修复后需额外进行分子标签的连接，这一 步不可避免会引入过量分子标签，会对建库过程产生一定干扰。另外，若分子 标签的连接效率较低或清洗不干净则会影响测序效率，并容易造成芯片上的纳 米孔堵塞，而本方案在扩增阶段直接将分子标签与引物结合，不会引入过量分 子标签，也不必担心连接效率。
22.本方案可将多个不同靶向扩增区域同时设计引物形成panel，用多重pcr技 术在一次pcr中即可实现不同靶向区域的扩增并添加分子标签。
23.在一些实施例中，扩增引物的序列和待测序序列上的序列片段相同，分子 标签序列直接与扩增引物的5’端连接，分子标签序列的另一端连接定位序列。
24.定位序列位于靶向扩增引物的边侧作为保护碱基，考虑到纳米孔测序技术 局限：靠近接头序列末端碱基读取错误较高，如果没有定位序列作为保护碱基 前提下，容易导致测序过程中由于分子标签序列未被正确读取电信号使得测序 数据转换以及后续barcode拆分丢失过多有用数据。除此之外，定位序列还可 用于快速定位靶向扩增引物测序reads以及平衡靶向扩增引物的碱基gc含量比。
25.在一些实施例中，扩增引物为16s基因通用引物，针对16s在保守区设计 得到。在一具体实施例中，扩增引物为覆盖16s基因的全序列的16s基因通用 引物。当然，本方案还
可适用于其他靶基因片段的扩增引物设计。
26.在一些实施例中，分子标签序列选自96种通用的分子标签序列的一种或者 多种。
27.在一些实施例中，该靶向扩增方法适用于所有细菌。
28.在一些实施例中，设计不同的多个靶向扩增引物，进而实现多靶向区域扩 增。
29.在一些实施例中，本方案适用于纳米孔测序平台。
30.在一些实施例中，经过靶向扩增后的多个扩增产物混样建库得到单一样品， 对单一样品进行末端修复。
31.另外，该基于纳米孔测序仪的靶向扩增引物的扩增建库方法可被应用所有 基于nanopore测序仪的靶向扩增测序，包括但不限于可被应用于各类细菌、古 菌、病毒等的纳米孔测序。
32.相较现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：
33.将靶向扩增引物设计为：定位序列+分子标签序列+扩增引物的组合序列， 也就是说，本方案直接将分子标签加在扩增引物的末端，将扩增产物末端修复 后与接头连接，在提高接头连接效率的同时直接引入高通量测序分子标签，避 免待测序列的分子标签污染，且可兼容不同靶向扩增区域的panel混合。
34.由于本方案将靶向扩增引物设计为：定位序列+分子标签序列+扩增引物的 组合序列，将基于纳米孔测序平台靶向扩增高通量测序整个过程仅分为靶向扩 增+混样末端修复+加接头测序三个步骤，提高接头连接效率，在保证靶向扩增 富集的同时又直接引入分子标签，同时选用接头连接效率最高的连接方案，且 简化实验复杂程度。
附图说明
35.图1是传统的低浓度核酸样本靶向扩增的测序接头连接的示意图。
36.图2是传统的高浓度核酸样本靶向扩增的测序接头连接的示意图。
37.图3是传统的高浓度核酸样本靶向扩增的测序接头连接的示意图。
38.图4是本方案提供的基于纳米孔测序仪分子标签拆分的靶向扩增方法的单 靶向区域的测序接头连接的示意图。
39.图5是本方案提供的基于纳米孔测序仪分子标签拆分的靶向扩增方法的多 靶向区域的测序接头连接的示意图。图6是对应实施例一的部分pcr产物的凝胶电泳图。图7是对应实施例一的部分pcr产物的测序片段图。图8是对应实施例二的部分部分pcr产物的胶图。图9是对应实施例二的部分pcr产物的测序片段图。图10是对应实施例三的部分部分pcr产物的胶图。图11是对应实施例三的部分pcr产物的测序片段图。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的
范围。
41.实施例一
42.一、样本来源:某儿童医院样本，包括气管抽吸物、肺泡灌洗液、血液和脑 脊液等。
43.二、靶向扩增引物设计：从ncbi上下载常见致病菌序列，然后针对16s基 因在保守区设计通用的扩增引物，接着按“5
′‑
定位序列+分子标签序列+扩增 引物序列-3
′”
的方式将96种不同的分子标签序列分别与扩增引物进行组合得 到靶向扩增引物。
44.设计的靶向扩增引物序列示例如下：
[0045][0046][0047]
三、靶向扩增：
[0048]
(1)用qubit4.0对样本dna进行定量；
[0049]
(2)按以下体系进行配置反应体系：
[0050]
组分体积hotstarthifi mix酶12.5μl引物0.5μl样本dna5-20ng无核酶水补充到25μl总体积25μl
[0051]
(3)在pcr仪上运行以下程序：
[0052][0053]
4)用1倍体积磁珠对pcr得到的扩增产物进行纯化(或根据测序需求取每个 独立barocde引物扩增后的产物直接混样后纯化)。
[0054]
5)用qubit对纯化的扩增产物进行定量。
[0055]
6)取等质量(qubit定量浓度
×
取样体积)的dna混合加入到新的1.5ml ep 管内，总核酸量为200-400ng，体积≤48.5μl。(超过48.5μl可用2倍体 积磁珠纯化或真空干燥浓缩，不足用无核酶水补足)。
[0056]
四、末端修复：
[0057]
按如下体系加入试剂组分
[0058]
mix成分体积混合dna48.5μlend repair enzymes(ere)3.5μlend repair buffer(erb)3μl总体积55μl
[0059]
此处的混合dna指的是前文得到的扩增产物等量混合。
[0060]
1)pcr仪上20℃，5min；65℃，5min后取出，需要暂停时可放置4℃ 不超过24h。
[0061]
2)提前将磁珠平衡到室温，震荡混匀后取30μl加到每个样本管内，轻弹 混匀并置于低速微震荡混匀仪上，室温孵育5min。
[0062]
3)短暂离心后将每管液体转移至新的1.5ml ep管，并放置在磁力架上吸附， 待液体变澄清。
[0063]
4)保持磁力吸附状态，吸去清液，沿管壁加入200μl wsb。勿扰动吸附的 磁珠，吸去清液。
[0064]
5)重复上一步。
[0065]
6)取下ep管短暂离心后放回磁力架上，吸去残余液体，自然风干约30s(勿 让聚集的磁珠干裂)，然后加入48μl无核酶水润洗磁珠。
[0066]
7)取下ep管轻弹重悬磁珠，室温放置2min，短暂离心后放回磁力架上，待 溶液变澄清，吸取47μl转移至新的1.5ml ep管内。
[0067]
五、接头连接：
[0068]
体系成分如下：
[0069]
mix成分体积末端修复dna47μladapter mix f(amx-f)5μlligation buffer(lnb)20μlquickligase(qle)8μl总体积55μl
[0070]
1)参照上述体系依次加入试剂，轻弹约10次，混匀后短暂离心，18-25℃孵 育10min。
[0071]
2)将磁珠震荡混匀后取40μl加到adapter连接体系中，轻弹混匀并置于 低速微震荡混匀仪上，室温孵育5min。
[0072]
3)短暂离心后放于磁力架上吸附，待液体变澄清；保持吸附状态，吸去清液。
[0073]
4)将ep管从磁力架上取下，沿磁珠被吸附的一侧缓慢加入200μl sfb，转 动ep管轻柔重悬磁珠后放回磁力架上(磁珠无贴壁成聚集块即可)，待液体 变澄清后吸去清液。
[0074]
5)重复上一步。
[0075]
6)取下ep管短暂离心后放回磁力架上，吸去残余液体，自然风干约30s (勿让聚集的磁珠干裂)，加入14μl elution buffer(eb)润洗磁珠。
[0076]
7)取下ep管轻弹重悬磁珠，室温放置10min。
[0077]
8)短暂离心后放回磁力架上，待液体变澄清，吸取14μl转移至新的1.5mlep管。
[0078]
9)取1μl连上接头的dna进行qubit定量。
[0079]
六、上机测序：
[0080]
用oxfordnanopore测序试剂盒sqk-lsk110在纳米孔测序仪gridion上进行上 机测序。
[0081]
1)取30μl flush tether(flt)加入flush buffer(fb)并混匀。
[0082]
2)顺时针旋转90
°
打开priming port，用1ml枪调至200μl，垂直接触 priming port孔缓慢旋转至230μl吸出管路中气泡，此时枪尖处有少量液 体，表示管路气泡排出。
[0083]
3)用1ml枪吸取800μl fb，通过顺时针旋转移液器体积设置轮/环(或直 接按压)从priming port孔匀速推入管路，注意枪尖保留少量液体，将芯 片室温再平衡5min。
[0084]
4)参照下述体系依次加入试剂和dna library：
[0085][0086]
其中dna文库指的就是接头完毕的样本。
[0087]
5)芯片平衡结束后，朝外轻拨打开spoton观察spoton sample port和 spoton sample cover周围是否有残留的白色结晶(第二次使用时易残留)。 如有残留，可用10μl枪
吸取少量fb溶解白色结晶并吸去液体，避免密封 不紧造成液体挥发产生气泡。
[0088]
6)1ml枪吸取200μl fb，通过顺时针旋转移液器量程调节轮/环从 priming port孔匀速推入管路，注意枪尖保留少量液体，使fb从spotonsample port涌出后又落回，从而润洗spoton sample port周围。
[0089]
7)轻轻上下吸取loading sample进行混匀，取75μl逐滴加入spotonsample port，可见loading beads均匀弥散开。
[0090]
8)先关闭spoton sample cover，然后逆时针旋转关闭priming port， 最后从waste port 1吸去管路中液体。放入测序仪上设置实验。
[0091]
七、测序结果分析：
[0092]
实验结果证明该方法能成功对临床样本中微生物的16s全长进行扩增和测序 鉴定，部分pcr产物凝胶电泳图和测序片段图如附图6和图7所示，该实施例 一中的16s扩增引物的扩增长度约为1300-1700bp。
[0093]
实施例二
[0094]
用上述方法对分离培养的14株细菌进行16s扩增测序鉴定。
[0095]
样本来源：某疾控中心实验室提供。
[0096]
测序结果证明本方法能成功对分离培养的细菌进行快速的16s全长扩增和鉴 定。部分pcr产物胶图和测序片段图如附图8-9所示。
[0097]
实施例三
[0098]
用同样方法对50例环境样本(土壤)中的微生物进行16s测序鉴定。
[0099]
样本来源：某海关实验室提供。
[0100]
测序结果证明本方法能成功对环境样本中的微生物进行快速的16s全长扩增 和鉴定。部分pcr产物胶图和测序片段图和如附图10-11所示。
[0101]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其 他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本技术 相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。