一种柑橘CsGSTU18基因及其应用

一种柑橘csgstu18基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种柑橘csgstu18基因及其应用。


背景技术：

2.柑橘溃疡病(citrus bacterial canker，cbc)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种(xanthomonas citri subsp.citri，xcc)引起的细菌性病害，其危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。
3.柑橘溃疡病的传统防控手段例如病树焚烧和农药使用等需要投入大量人力和物力，且会造成巨大环境危害。因此，柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。分子育种由于可定向、高效培育抗病新种质，目前得到快速发展和广泛应用。近年来，通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病的柑橘资源，如过表达csbzip40和cswakl08获得的转基因晚锦橙株系(li et al.，2019；li et al.，2020)；基因定点编辑cslob1启动子获得的转基因晚锦橙株系(peng et al.，2017)。但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，因此，亟待有针对性地挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关的基因，深入解析其功能和机制，用于抗溃疡病分子育种。
4.谷胱甘肽-s-转移酶，普遍存在于动物、植物和微生物中，是一类由多个基因编码、具有多种功能的超家族酶。根据植物蛋白质的同源性和基因结构特征，gst家族分为f(phi)、u(tau)、t(theta)、z(zeta)、l(lambda)、dhar、ef1bγ和tchqd共8个亚家族，其中f亚家族和u亚家族是植物特有的，与其他亚家族相比，其成员最多，含量也最为丰富(jain et al.，2010)。目前植物gst蛋白已先后在玉米、拟南芥、大豆、水稻、烟草等植物中相继发现，且在植物中具有解毒、代谢物运输、胁迫调控、调控生长发育、信号传导等功能。虽然gst调控在植物病害抗性中已有部分应用，但在柑橘溃疡病领域尚未有相关研究报道。
5.有鉴于此，特提出本技术。


技术实现要素：

6.本发明为提高柑橘对溃疡病的抗性，提供一种柑橘csgstu18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，首次克隆获得柑橘csgstu18基因，并通过将柑橘csgstu18基因的vigs载体转到柑橘中，降低柑橘csgstu18的转录水平，能够显著提高柑橘对溃疡病的抗性，降低溃疡病的发病程度，并且不影响转基因植株的表型。
7.本发明通过下述技术方案实现：
8.一种柑橘csgstu18基因，所述柑橘csgstu18基因的核苷酸序列为seq id no：1所示或者在seq id no：1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有编码同等活性蛋白的核苷酸序列。
9.本发明还提供一种柑橘csgstu18基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，应用方法为降低柑橘属植物中csgstu18基因的转录水平。
10.进一步的，降低柑橘属植物中csgstu18基因转录水平的方式采用vigs沉默。
11.进一步的，应用方法具体包括以下步骤：
12.(1)克隆柑橘csgstu18基因的vigs片段；
13.(2)构建vigs的表达载体；
14.(3)vigs表达载体转化柑橘，得到柑橘csgstu18基因被沉默的vigs植株。
15.进一步的，步骤(1)中，柑橘csgstu18基因的vigs片段的克隆方法为：提取柑橘总rna，反转录为cdna，以cdna为模板用高保真酶pcr扩增得到柑橘csgstu18基因的vigs片段，核苷酸序列为seq id no：2所示。
16.进一步的，步骤(1)中，pcr扩增所用的引物为csgstu18-vigs-f和csgstu18-vigs-r，其核苷酸序列分别为seq id no：3和seq id no：4。
17.进一步的，步骤(2)中，vigs基因片段表达载体的构建方法为：将步骤(1)获得的pcr产物柑橘csgstu18基因的vigs片段经xba i和sma i酶切，回收后与相同酶切的trv2载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到csgstu18基因的vigs表达载体。
18.进一步的，步骤(3)中，vigs表达载体转化柑橘的方法为：将步骤(2)获得的vigs表达载体转化农杆菌，制备含vigs表达载体的农杆菌菌液，侵染柑橘无菌幼苗，经荧光观察、pcr和qrt-pcr验证后得到柑橘csgstu18基因被沉默的vigs植株。
19.进一步的，步骤(3)得到vigs植株后，对vigs植株进行柑橘溃疡病抗性评价，判定柑橘csgstu18基因沉默能够增强柑橘溃疡病抗性。
20.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
21.1、本发明实施例提供的一种柑橘csgstu18基因，从柑橘感染溃疡病前后差异表达的基因中获得的一个在抗病品种中受柑橘溃疡病菌侵染早期表达下调、在感病品种中侵染早期上调的谷胱甘肽-s-转移酶csgstu18，在瞬时过表达时可降低柑橘细胞中的h2o2含量，表明csgstu18基因是柑橘溃疡病的一个感病基因；
22.2、本发明实施例提供的一种柑橘csgstu18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过构建柑橘csgstu18基因的vigs载体，农杆菌介导转化柑橘，得到的柑橘植株能够对溃疡病表现明显抗性，病斑面积降低了36％，病情指数降低了21％，显著减轻溃疡病的发病程度；
23.3、本发明实施例提供的一种柑橘csgstu18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过柑橘csgstu18基因vigs沉默能够显著减轻柑橘溃疡病的发病程度，且柑橘csgstu18基因vigs沉默不会影响柑橘植株的表型；
24.4、本发明实施例提供的一种柑橘csgstu18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过对vigs沉默植株的谷胱甘肽-s-转移酶活性和h2o2含量检测，表明柑橘csgstu18基因沉默可通过增加h2o2含量，进而增强柑橘csgstu18沉默植株的溃疡病抗性；
25.5、本发明实施例提供的一种柑橘csgstu18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，柑橘csgstu18基因还可以作为候选基因同多个溃疡病抗、感病基因利用vigs沉默、rna干扰和基因编辑等技术协同进行溃疡病抗性育种，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
27.图1为本发明实施例柑橘csgstu18的生物信息学特征图：a，柑橘csgstu18基因的染色体定位；b，柑橘csgstu18的基因结构；c，柑橘csgstu18的保守结构域；
28.图2为本发明实施例柑橘csgstu18的柑橘溃疡病菌诱导表达图：数据柱上的字母表示差异显著性(p《0.05)；
29.图3为本发明实施例柑橘csgstu18的激素诱导表达图：数据柱上的字母表示差异显著性(p《0.05)；
30.图4为本发明实施例构建柑橘csgstu18瞬时过表达载体图：gus：β-葡萄糖醛酸酶基因；nptii，卡那霉素抗性基因；35s，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；lb，左同源臂；rb，右同源臂；
31.图5为本发明实施例瞬时过表达材料中柑橘csgstu18的相对表达量：*，差异显著性(p＝0.05)；
32.图6为本发明实施例瞬时过表达材料中gst酶活和h2o2含量：a，gst酶活；b，h2o2含量；plgne，瞬时转化空载体的材料；plgne-gstu18，瞬时转化csgstu18过表达载体的材料；
33.图7为本发明实施例利用柑橘csgstu18基因进行vigs沉默以提高柑橘溃疡病抗性的具体实施流程图；
34.图8为本发明实施例柑橘csgstu18基因vigs载体图：gfp，绿色荧光蛋白；rdrp，na依赖性rna聚合酶；cp，外壳蛋白；35s，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；lb，左同源臂；rb，右同源臂；
35.图9为本发明实施例vigs植株pcr检测图：+，阳性对照；-，阴性对照；m，分子量标准；1，csgstu18的vigs植株；trv1、trv2，两个载体的检测结果图；
36.图10为本发明实施例vigs植株中csgstu18表达的qrt-pcr检测图：*，差异显著(p＝0.05)(下同)；trv2，空载体的植株(下同)；trv2-gstu18，转csgstu18的vigs载体的植株(下同)；
37.图11为本发明实施例vigs植株表型图：wt，未转基因植株；
38.图12为本发明实施例vigs植株叶片接种溃疡病菌后的发病情况；
39.图13为本发明实施例vigs植株叶片接种溃疡病菌后病斑大小统计图；
40.图14为本发明实施例vigs植株叶片接种溃疡病菌后病情指数统计图；
41.图15为本发明实施例vigs植株gst酶活和h2o2含量：a，gst酶活；b，h2o2含量。
具体实施方式
42.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
43.在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本
领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的材料或方法。
44.在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
45.实施例1
46.柑橘csgstu18的生物信息学分析
47.如图1所示，柑橘csgstu18基因位于柑橘8号染色体的21615861bp到21617129bp之间(图1a)，含有1个内含子和2个外显子，编码223个氨基酸(图1b)，n端和c端分别含有gst功能结构域(图1c)。
48.csgstu18基因核苷酸序列seq id no：1：
49.atggctgaagaagaagtgaagctctatggcacatgggtaagcccttttagtcgcagaatcgagcttgcactgaaactgaaaggggttccgtttgagtacataggagtagatctgtccaacaagagtcctgaacttctgaaatacaatccaattcacaagaaaatcccagtgcttgtacacaatggcaaatcaattgttgaatctctaatcattctcgagtacatcgacgacacgtggaagaataatcctattttgcctcgagatcctcatcaaagagccgtggctcgcttctgggctaagttcatcgacgaaaagctgttggcaacaggaatgaaggccagtttagctgaagggaaggagaaagagctgttgaatgaagaaatacttgagcagatgaaattgctggagaatgaactcaatggaaaagacttctttggaggtgaggcgattgggcttgttgacattgttgcaactgtggtcgcattttggttcccagtaagccatgaagttcttggagtagaagtaatcactcaggaaaagtttccagttttactcaaatggattgggaagcttcaagagattgatgtggtgagccaaagccgacctccaagagagaagcatgttgctcatgttagagctcgcatggaaggcctcaattcaggttcaaagtaa。
50.实施例2
51.柑橘csgstu18的表达分析
52.1.柑橘csgstu18的柑橘溃疡病菌诱导表达
53.为验证柑橘csgstu18与柑橘溃疡病菌侵染之间的关系，通过在抗病品种金柑和感病品种晚锦橙中注射接种柑橘溃疡病菌，以柑橘csgstu18特异性区域设计qrt-pcr引物csgstu18-rt-f和csgstu18-rt-r。
54.qrt-pcr反应条件：95℃3min，95℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min；利用2
‑△△
ct
法计算植株中csgstu18基因的相对表达量。
55.引物csgstu18-rt-f的核苷酸序列seq id no：5如下所示：
56.atcgacgaaaagctgttggc
57.引物csgstu18-rt-r核苷酸序列seq id no：6如下所示：
58.tcaacagctctttctccttccc。
59.对csgstu18受柑橘溃疡病菌侵染的诱导表达特性进行分析发现，如图2所示：晚锦橙中，csgstu18的表达量在柑橘溃疡病菌侵染早期表达量明显上升，而金柑中，csgstu18在柑橘溃疡病菌侵染过程中表达量持续下降。根据上述结果能够推测出csgstu18可能是柑橘
溃疡病的感病基因，其表达水平与溃疡病抗性呈负相关。
60.2.柑橘csgstu18的激素诱导表达
61.为进一步确定柑橘csgstu18与柑橘溃疡病的相关性，对植物生物胁迫相关的激素脱落酸(abscisic acid，aba)、茉莉酸(jasmonic acid，ja)和水杨酸(salicylic acid，sa)对csgstu18的诱导表达进行了分析，如图3所示，结果发现晚锦橙和金柑受3种激素诱导后，csgstu18都有不同的表达模式，表明csgstu18不同程度地响应这3种激素的信号转导途径，也进一步验证了csgstu18与柑橘抗、感溃疡病相关。
62.3.柑橘csgstu18的瞬时过表达
63.为分析csgstu18在柑橘细胞h2o2含量调控中的功能，如图4所示，将csgstu18基因插入plgne载体构建csgstu18过表达载体plgne-csgstu18，并瞬时注射晚锦橙叶片。经验证，如图5所示，csgstu18在瞬时过表达5天的材料中得到明显过表达，从图6可以看出，过表达材料的gst酶活明显增加(图6a)，h2o2含量明显降低(图6b)，进一步表明csgstu18基因是柑橘溃疡病的感病基因。
64.实施例3
65.利用柑橘csgstu18沉默提高柑橘溃疡病抗性
66.如图7所示，本发明利用csgstu18沉默以提高柑橘溃疡病抗性的具体实施流程包括vigs片段克隆、载体构建、柑橘转化、阳性鉴定和抗性评价。
67.1.vigs片段克隆
68.1)rna提取及cdna合成
69.用rna提取试剂盒(艾德莱，cat：rn09)提取晚锦橙的总rna，使用recombinant dnase i(takara)反转录合成cdna，得到csgstu18基因的vigs片段，其核苷酸序列seq id no：2如下所示：
70.aatgaagaaatacttgagcagatgaaattgctggagaatgaactcaatggaaaagacttctttggaggtgaggcgattgggcttgttgacattgttgcaactgtggtcgcattttggttcccagtaagccatgaagttcttggagtagaagtaatcactcaggaaaagtttccagttttactcaaatggattgggaagcttcaagagattgatgtggtgagccaaagccgacctccaagagagaagcatgttgctcatgttagagctcgcatggaaggcctcaattcaggttcaaagtaa。
71.2)csgstu18基因的vigs片段扩增
72.1.2.1用primestar master mix(takara)试剂盒克隆csgstu18基因的vigs片段，长度为300bp；
73.1.2.2利用引物csgstu18-vigs-f和csgstu18-vigs-r进行pcr扩增；
74.1.2.3切含有目的片段的琼脂糖凝胶，利用dna凝胶回收试剂盒(艾德莱)回收rnai片段。
75.pcr反应条件：98℃，5min；98℃，30s，56℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。
76.引物csgstu18-vigs-f的核苷酸序列seq id no：3如下所示：
77.gctctagaaatgaagaaatacttgagc
78.引物csgstu18-vigs-r的核苷酸序列seq id no：4如下所示：
79.gccccgggttactttgaacctgaattgaggcc。
80.2.vigs载体构建
81.如图8所示，将vigs载体trv2和csgstu18基因的vigs片段用xba i和sma i酶切，凝胶回收，然后将两个片段连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到vigs表达载体trv2-csgstu18；其中，gfp：绿色荧光蛋白；rdrp：na依赖性rna聚合酶；cp：外壳蛋白；35s：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；nos：冠瘿碱合成酶基因终止子；lb：左同源臂；rb：右同源臂。将载体trv2-csgstu18通过电击法转化农杆菌，制备含vigs表达载体的农杆菌菌液。
82.3.vigs载体转化
83.1)农杆菌活化
84.分别取500μl trv1与trv2、trv2-csgstu18农杆菌菌液加至50ml液体lb培养基(含卡那霉素)，于28℃，200r
·
min-1
培养至od
600
＝1；收集菌体，用mma(10mm mgcl2、10nm mes、100μm乙酰丁香酮)液体重悬，调整od
600
＝1；将trv1分别与trv2、trv2-gstu18载体按照体积比1:1混匀，室温温育3h。
85.2)农杆菌侵染
86.将胚根长至3cm的无菌幼苗浸入农杆菌菌液，用真空泵抽真空1min；用无菌水冲洗3～5遍，插入种子培养基中室温黑暗下培养2～3d，观察若发出绿色荧光即为阳性苗，转移到土壤中培养，25℃下光/暗16h/8h培养，定期浇水。
87.4.vigs阳性鉴定和表型观察
88.紫外光下显示绿色荧光的为阳性苗，随后转移至营养土培养基，一个月后，采集组织提取dna和总rna，利用两对引物csgstu18-id1-f、csgstu18-id1-r和csgstu18-id2-f、csgstu18-id2-r进行pcr验证，分别获得了trv1和trv2载体片段，如图9所示。
89.引物csgstu18-id1-f的核苷酸序列seq id no：7如下所示：
90.ttgggttgctactgattcgact
91.引物csgstu18-id1-r的核苷酸序列seq id no：8如下所示：
92.ctgtaaggaccatcatacttcgc
93.引物csgstu18-id2-f的核苷酸序列seq id no：9如下所示：
94.ctgcccgacaaccactacct
95.引物csgstu18-id2-r的核苷酸序列seq id no：10如下所示：
96.cttgtacagctcgtccatgcc。
97.pcr反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。
98.利用引物csgstu18-rt-f和csgstu18-rt-r进行qrt-pcr，验证csgstu18是否被成功沉默。将转trv1和trv2空载体植株的基因表达水平设定为1，若含有目的片段载体的植株csgstu18基因表达水平小于1，则发生了基因沉默。经过鉴定，如图10所示，csgstu18转录水平下降了33％。
99.qrt-pcr反应条件：95℃3min，95℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。
100.如图11所示，经过荧光观察、pcr鉴定和qrt-pcr鉴定后的阳性植株的表型同野生型比较无明显差异，表明csgstu18的沉默未对柑橘的生长发育造成不利影响。
101.5.抗性评价
102.利用离体针刺法对vigs植株进行溃疡病抗性评价，具体操作如下：
103.采集成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒后置于超纯水中冲洗；以叶脉为中心进行针刺,用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μl(1
×
105cfu
·
ml-1
)，于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)；叶片点菌后培养10d拍照，用image j v1.47统计病斑大小。
104.根据病情指数公式计算病情指数，按照病斑面积将病情分为0-7级，以字母r表示病斑面积，0级(r≤0.25mm2)，1级(0.25mm2＜r≤0.5mm2)，2级(0.5mm2＜r≤0.75mm2)，3级(0.75mm2＜r≤1mm2)，4级(1.0mm2＜r≤1.25mm2)，5级(1.25mm2＜r≤1.5mm2)，6级(1.5mm2＜r≤1.75mm2)，7级(r＞1.75mm2)。根据公式计算发病程度：di＝100
×
σ【各级病斑数
×
相应级数值】/(病斑总数
×
最大级数)。
105.如图12-14所示，接种溃疡病菌10d后，csgstu18的vigs植株症状明显减轻；病斑面积降低了36％；病情指数降低了21％。因此，csgstu18基因沉默可增强柑橘溃疡病抗性。
106.实施例4
107.分析柑橘csgstu18沉默提高柑橘溃疡病抗性的机制
108.如图15所示，对csgstu18沉默植株的gst酶活和h2o2含量进行检测，发现gst酶活明显降低，而h2o2含量明显升高。h2o2是植物应对生物胁迫的重要信号分子，由此可见，csgstu18通过调控h2o2含量影响柑橘溃疡病抗性。
109.综上，本发明通过csgstu18的沉默可很大程度上降低柑橘溃疡病的病斑面积，减轻溃疡病的发病程度。本发明提供的csgstu18基因可以通过多种技术对其进行沉默，用作抗溃疡病分子育种，也可以与其他的抗病或感病基因一起，协同进行柑橘抗溃疡病分子育种，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。
110.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。