一种与萝卜抗根肿病相关的KASP分子标记及其应用

一种与萝卜抗根肿病相关的kasp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及萝卜根肿病的分子标记，属于生物检测领域。


背景技术：

2.根肿病是世界范围内的毁灭性土传植物病害，可造成20％～90％的严重减产。主要危害十字花科作物，如萝卜、油菜、白菜、甘蓝等。根肿病的病原为芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicae)。
3.萝卜(raphanussativus l.，2n＝18)，为十字花科萝卜属作物，是我国重要的传统蔬菜，并在世界各地广泛种植。近年来，在湖北、河南、云南、四川以及东北地区，萝卜根肿病发生逐渐增多，个别地区甚至爆发根肿病，导致土地无法耕种而抛荒或者改种其他作物。
4.萝卜田间根肿病的发生受到多种环境因素影响，在田间温度10～30℃，土壤相对湿度60％～98％，ph为5.4～6.5时，根肿病均能发生。萝卜发病初期，地上部分无明显症状，主根或侧根形成形状不一、大小不等，呈零星或簇状连片分布的肿瘤；随着肿瘤逐渐膨大或增多，影响植物吸收养分，导致植株生长缓慢，叶片萎蔫失绿；感病后期，在主根上表现龟裂、孔洞、塌陷和畸形等症状；肿瘤也会受到杂菌侵染，根部腐烂变臭。
5.目前预防根肿病主要有农业措施、生物防治和化学防治，选育抗病品种是防治萝卜根肿病最经济有效的策略。然而，国内外关于萝卜抗根肿病定位的研究较少，缺乏具有应用价值的分子标记，限制了其在分子育种中的应用。
6.使用与根肿病抗性基因紧密连锁的分子标记，在苗期就可对植株抗性进行筛选与鉴定，提高抗病材料鉴定效率，有效缩短抗根肿病品种的培育年限。因此，开发萝卜抗根肿病连锁分子标记，对萝卜抗根肿病品种的培育具有重要的应用价值。
7.萝卜中关于抗根肿病遗传机制及分子标记研究报道较少。国内外学者尽管从不同的种质中鉴定出萝卜抗根肿病qtl位点，但遗传距离较远或为数量位点控制，导致开发的分子标记无法快速有效应用于育种实践。


技术实现要素：

8.本发明的是在定位的萝卜抗根肿病qtl区间内，开发了与性状紧密连锁的分子标记并验证了标记的可靠性，通过检测该分子标记就可以预测萝卜对根肿病的抗性，为实现萝卜抗根肿病的的鉴定和筛选提供了分子标记辅助选择技术。
9.本发明第一个方面，提供一种snp分子标记，所述snp分子标记位点位于萝卜2号染色体第21832653个碱基处，snp标记为g到a转换，通过提取该标记上下游100个碱基的序列信息(gcgtgatggactctgctcggtcagcgagcttccaccagaggagtaacgt[g/a]aacaagatgcagagaggagagagaggttcggtttcatcactgagcacgac)，利用引物设计软件，将该标记转化为kasp标记，通过利用高通量的intelliqube基因分型检测平台进行基于竞争性等位基因特异性pcr(ksap技术)的snp基因分型检测试验，实现标记的多态性检验，从而实现对萝卜抗根肿病的分子标记辅助筛选。
[0010]
本发明的第二个方面提供一种检测snp的特异性引物组，所述的引物组为snp标记转化后的kasp引物，所述的引物序列为：
[0011]
正向引物1，f-1:ctctctcctctctgcatcttgttt
[0012]
正向引物2，f-2:ctctctcctctctgcatcttgttc
[0013]
反向引物，r:tgctcggtcagcgagcttccac。
[0014]
本发明的第三个方面是提供一种snp的检测方法，所述的方法是采用第二方面所述的引物，以提取的植物的基因组为模板，通过利用高通量的intelliqube基因分型检测平台进行基于竞争性等位基因特异性pcr(kasp)反应，所述的kasp反应体系：反应体系参照lgc公司的intelliqube平台说明书进行，具体包含kasp引物混合物、kasp主混合物和dna模板。其中kasp引物混合物包含两条等位基因特异性正向引物和一条共用反向引物；kasp主混合物包含f-1尾部fam标记的寡序列，f-2尾部hex标记的寡序列，fam染料，hex染料，淬灭剂；dna模板是萝卜基因组dna。
[0015]
在一个具体的实施例中，所述的
[0016]
kasp试验步骤：以下步骤可简化
[0017]
1.将dna样品分装到96孔pcr板上。将dna样品调制成统一的适宜的浓度(5-10ng/μl)，加到96孔pcr板上，每块pcr板加2个阴性对照(ntc)。
[0018]
2.配制kasp基因分型混合液。参照384孔array tape，其中湿dna：0.8ul，2x kasp master mix+assay：0.8ul，总反应体积：1.6ul
[0019]
3.将kasp基因分型混合液加到已含dna模板的array tape膜上。利用intelliqube的snp基因检测平台编制程序，并依次将384array tape、dna样品板、kasp基因分型混合液放置进机器，操作机器执行程序，分别自动进行dna样品稀释液和kasp基因分型混合液向384孔的array tape分装、封膜的过程。
[0020]
4.进行pcr循环反应。pcr反应可在intelliqube机器内以snp genotyping inline(单张膜时)模式进行，亦可在hydrocycler内以snp genotyping outline(多张膜时)模式进行水浴pcr。程序设置如下：1.预变性：温度94℃，15min，1次循环；2.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度61-55℃，60sec(-0.6℃/循环)；第2步10次循环；3.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度55℃，60sec，第3步26次循环。
[0021]
5.荧光数据读取和分析。pcr反应结束后，利用intelliqube机器进行荧光数据读取和分析。荧光fam激发(nm)485，发射(nm)520；hex激发535，发射556，rox激发575，发射610。
[0022]
6.加循环。如果数据荧光信号较低，分群较散，可增加循环后进行荧光读取。加循环的条件如下：变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度57℃，60sec，循环数为3。
[0023]
kasp分型结果：
[0024]
首先，以上引物和所述方法能够在萝卜上检测与抗根肿病相关的主效qtl位点是否存在，同时检测标记的多态性类型，标记类型与相应的植株抗性表型一致，通过标记类型预判萝卜对根肿病的抗性。
[0025]
本发明的有益效果：本发明通过qtl-seq技术以及遗传图谱定位发现了位于萝卜2号染色体上与抗根肿病相关的主效qtl位点，并进一步开发了与位点紧密连锁的分子标记，通过对抗性未知萝卜材料的种子或者苗期叶片提取dna，结合本发明的kasp引物进行kasp
分子标记分型试验，通过标记的分型结果就可以预测萝卜对根肿病的抗性，而不用采用人工鉴定的方法，可以明显提高育种效率，节约育种成本。
附图说明
[0026]
图1萝卜抗根肿病qtl-seq定位图，在2号染色体，有明显的峰值区域，以99％置信区间可划定出主效qtl位点。
[0027]
图2利用分子标记的对196株植株kasp分型结果进行分析：蓝色代表一种碱基类型(tt)，红色代表碱基类型(cc),紫色代表杂合类型(tc),灰色表示空白对照。同时，tt碱基类型的萝卜为感病，cc和tc类型的萝卜为抗病，对于未知抗性的材料，经标记kasp分型后，植株抗性与相同标记类型的植株抗性一致。
具体实施方式
[0028]
以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，需明确：本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0029]
面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0030]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031]
实施例1、样本基因库获得
[0032]
利用水萝卜
‘
llyh’和樱桃萝卜
‘
hd’杂交获得f1，f1自交获得131株f2分离群体为研究对象。
[0033]
对于f2单株，以采自河南新野的根肿菌4号生理小种为接种物，采用苗期注射法鉴定，根据接种结果，在f2代群体中选取感病的40个单株混为感病池，利用改良的ctab法提取极端单株和亲本dna。
[0034]
实施例2、snp获得
[0035]
采用illumina hiseqtm pe150对两个亲本和感病池进行测序，亲本测序深度为10
×
，混池测序深度为40
×
。
[0036]
利用极端性状混池测序qtl-seq方法，计算snp-index。进行1000次置换检验，选取95％置信水平作为筛选的阈值，在萝卜第2号染色体检测到了与抗根肿病相关的主效qtl位点。
[0037]
该位点所处物理位置为2号染色体的10.2～14.5mb区间，该区间内有鉴定的3340个snp位点，在该区间内选取9个多态性snp位点，分别提取上下游各50bp的碱基序列，按照引物设计原则，设计kasp标记引物。
[0038]
在2号染色体第21832653个碱基处，根据snp位点信息开发的kasp引物，其序列信息为：
[0039]
正向引物1，f-1:ctctctcctctctgcatcttgttt
[0040]
正向引物2，f-2:ctctctcctctctgcatcttgttc
[0041]
反向引物，r:tgctcggtcagcgagcttccac
[0042]
利用lgc公司的intelliqube平台对亲本及f2代不同抗性单株进行基于ksap技术的snp基因分型检测试验，具体参照说明书中的kasp试验步骤进行试验。
[0043]
该分子标记的kasp分型结果进行分析，196株f2分为3种基因型，其中，43株为tt类型，均为感病植株，基因型与感病亲本“llyh”一致；51株为cc类，均为抗病植株，基因型与抗病亲本“hd”一致；43株基因型为tc杂合类型，表现为抗病型。分析显示三种类型的基因型cc类和tc类个体均为抗病植株，tt类为感病植株。
[0044]
实施例3、snp符合性验证
[0045]
利用实施例2所述的方法对87株f2分为3种基因型，其中，20株为tt类型，均为感病植株，基因型与感病亲本“llyh”一致；24株为cc类，均为抗病植株，基因型与抗病亲本“hd”一致；102株基因型为tc杂合类型，表现为抗病型。分析显示三种类型的基因型cc类和tc类个体均为抗病植株，tt类为感病植株。
[0046]
因此，通过对比植株抗病的表型和kasp分型试验结果，证明2号染色体第21832653个碱基处的snp标记与萝卜抗根肿病性状紧密连锁，可以用于检测萝卜抗根肿病的差异(如图2所示)。
[0047]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。