1.本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及一种鉴定陆地棉红叶矮杆的分子标记及方法和应用。
背景技术：
2.棉花株型结构主要包括株高、果枝数、叶片大小以及叶和果枝的排列等，直接影响棉花的产量和品质。株高是影响株型的一个决定性因素，是决定作物种植密度和影响产量的主要农艺性状。矮秆、半矮秆品种具备提高光合利用率，增加倒伏抗性、不易遭受病原菌侵袭等优点，对于节约生产成本、提高肥料利用率和提高产量具有重要意义。
3.棉花具有无限生长习性，植株高大。现如今常规的矮化栽培措施是采用生长延缓剂处理如：缩节胺等，随着这种生长延缓剂使用的越来越广泛其弊端也越来越不容忽视，特别是环境污染问题。因此，充分利用矮杆材料，选育矮杆品种是提高产量、提高农业生产效率的重要措施。棉花矮杆种质在矮化育种中具有重要的利用价值，不仅为培育理想株型的棉花矮化品种提供重要的基因资源，同时也是研究植物茎的生长及激素调控的理想材料。
4.到目前为止，在陆地棉中共定位克隆到3个与花青素积累有关的基因位点：r1、r2、和rs。具有r1(ghpap1d/ghrlc1)或rs(ghpap1a)基因的棉花植株都表现为红叶、红茎和红花，其中rs的红色表型相比r1颜色稍浅，表现出亚红叶表型。具有r2(gbbm)基因的棉花植株具有明显的花瓣基斑表型，但植株的叶和茎秆表现为正常的绿色。棉花中除以上3个与花青素积累有关的基因位点外，还有一个rd位点，rd突变体植株表现为红叶矮秆，但rd基因还没有明确的染色体定位信息，也没有可用的连锁标记。富含花青素的棉花种质资源可为棉花抗逆与彩色棉育种提供基因资源和理论基础。
5.本课题在对种质资源库引进品种矮红株的研究中，将其与高杆材料新陆早74杂交构建f2代分离群体，通过bsa-seq和gbts目标区域捕获等手段对矮红株红叶矮秆性状定位，旨在开发一种与矮红株红叶矮秆性状紧密连锁的分子标记，在利用陆地棉品种矮红株进行棉花的矮化育种中开展分子标记辅助筛选，从而加快育种进程。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于开发一种与陆地棉红叶矮秆性状紧密连锁的分子标记，实现对陆地棉红叶矮秆性状的快速、准确选择，开展分子辅助育种。
7.通过以下技术手段来实现上述目的：
8.本发明提供了一种鉴定陆地棉红叶矮杆的indel分子标记，所述indel分子标记为棉花第a09染色体上第79598917位碱基的基因型为act或a。
9.本发明还提供了一种上述indel分子标记在鉴定陆地棉红叶矮杆中的应用。
10.作为上述技术方案的进一步改进，若基因型为a，则表明待鉴定棉花为红叶矮杆性状，若基因型为act，则表明待鉴定棉花为绿叶高秆性状。
11.本发明还提供了一种鉴定陆地棉红叶矮杆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
12.步骤s1、提取待检测棉花组织dna；
13.步骤s2、以权利要求1所述的indel分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；
14.步骤s3、对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测棉花的分子标记类型；
15.步骤s4、根据分子标记类型判断棉花性状。
16.作为上述技术方案的进一步改进，若基因型为a，则表明待鉴定棉花为红叶矮杆性状，若基因型为act，则表明待鉴定棉花为绿叶高秆性状。
17.作为上述技术方案的进一步改进，所述特异性扩增引物正向引物序列为：5'-cagggaccgtgaagaactcgt-3'；所述特异性扩增引物反向引物序列为：5'-ccatgtccgattctctggttgc-3'。
18.作为上述技术方案的进一步改进，所述pcr扩增体系为：2μl浓度为50～500ng/μl的dna，特异性扩增引物正反向引物各为10
×
pcr buffer 2μl，2.5mm dntp 1.6μl，taqdna polymerase 0.4μl，ddh2o 12μl，总反应体系为20μl。
19.作为上述技术方案的进一步改进，所述pcr扩增程序为：
①
95℃预变性5min；
②
95℃变性30s；
③
60℃退火30s；
④
72℃延伸30s；其中
②‑④
32个循环；
⑤
72℃终延伸10min；
⑥
4℃保存扩增产物。
20.本发明还提供了一种上述indel分子标记在棉花遗传育种上的应用。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明提供的与陆地棉矮红株红叶矮秆性状紧密连锁的indel分子标记，直接以dna的形式表现，不受季节和生育时期的限制，且在f2分离群体中能与表型变异相对应。可用于陆地棉矮红株红叶矮秆性状的分子标记辅助选择，为棉花矮化机理研究、棉花矮化品种的选育提供一定的理论依据。
附图说明
23.图1为陆地棉新陆早74(左，绿叶高杆)和矮红株(右，红叶矮杆)的表型。
具体实施方式
24.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术做出一些非本质的改进和调整。
25.1.材料
26.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
27.2.方法
28.2.1.与陆地棉矮红株红叶矮秆性状紧密连锁的分子标记的获得
29.(1)将矮红株(红叶矮杆，图1中右图所示，来源于国家棉花种质资源中期库)作为父本，将绿叶高杆材料新陆早74(图1中左图所示，来源于国家棉花种质资源中期库)作为母本进行杂交，获得f1代，然后自交产生包含有528个单株的f2代分离群体。为控制田间试验
的系统误差，所有材料均种植在同一地块，以保证环境条件一致。
30.(2)选取f2代极端高株和极端矮株各30株，和两个亲本一起进行bsa混池测序，分析得到一个6.54mb初定位的区间，区间内基于差异位点开发47个分子标记。
31.(3)提取f2代群体单株幼嫩叶片dna，利用gbts基因分型、目标区域捕获的方法结合单株表型，最终筛选到一个与陆地棉矮红株红叶矮秆表型共分离的indel分子标记。
32.(4)利用该indel分子标记，在f2代群体单株中进行pcr扩增，并对扩增产物进行测序，当indel分子标记位点的基因型为a时表现为红叶矮株，当indel分子标记位点的基因型为act时表现为绿叶高秆。
33.(5)具体反应体系和程序如下：
34.pcr扩增体系为：2μl浓度为50～500ng/μl的基因组dna，表1所示的上游引物、下游引物均为1μl，10
×
pcr buffer 2μl，2.5mm dntp 1.6μl，taq dna polymerase 0.4μl，ddh2o 12μl，总反应体系为20μl。pcr扩增程序为：
①
95℃预变性5min；
②
95℃变性30s；
③
60℃退火30s；
④
72℃延伸30s；其中
②‑④
32个循环；
⑤
72℃终延伸10min；
⑥
4℃保存扩增产物。
35.基于bsa-seq和基于靶向测序的基因型分型技术(gbts,genotyping by target sequencing)，克隆得到一个控制陆地棉矮红株红叶矮杆性状基因ghdr。ghdr基因编码一个bbx24蛋白，在该基因第三个外显子上存在一个2bp的移码突变。同时，基于此突变位点开发了一个与陆地棉矮红株红叶矮杆性状共分离的indel分子标记，该indel分子标记位于a09染色体上第79598917位及其上下游的核苷酸序列，多态性为野生型act或突变体a，该indel分子标记直接以dna的形式展现出来，不受环境和生育时期的限制，使用该分子标记的特异性引物对目标区域捕获，依据扩增产物测序结果可以鉴别陆地棉矮红株红叶矮杆性状。
36.表1.indel位点
[0037][0038]
2.2 indel检测
[0039]
为验证上述indel分子标记的可靠性，我们用f2群体的单株作为实验对象，用indel分子标记对应的引物进行pcr扩增，然后测序验证，以得到可靠的分析结果。步骤如下：
[0040]
(1)用f2群体的dna作为模板，分别使用特异性引物进行pcr扩增，引物如下：
[0041]
表2.indel特异性引物
[0042][0043]
pcr扩增体系如下所示：2μl浓度为50～500ng/μl的基因组dna，上表中所示的上游
引物、下游引物均为1μl，10
×
pcr buffer2μl，2.5mm dntp1.6μl，taqdna poly merase0.4μl，ddh2o12μl，总反应体系为20μl。pcr扩增程序为：
①
95℃预变性5min；
②
95℃变性30s；
③
60℃退火30s；
④
72℃延伸30s；其中
②‑④
32个循环；
⑤
72℃终延伸10min；
⑥
4℃保存扩增产物。indel分子标记indela09的扩增产物核苷酸序列为：cagggaccgtgaagaactcgtcatcttcatccggggtttcgattctaggcttcttaagagccatggaatatttggtgggtcggtataagtttgtactgcttgattgcgatatcggaagttgaggaacttcagctgctgctaaagcctcctgtggcaattgatcaccaaaaagaccgatgtctgctagccattcaagctctccaagctcagagtgctctttctgcaaccagagaatcggacatgg
[0044]
其中，下划线标示为引物结合位置，加粗为红叶矮杆材料基因组2个碱基的缺失位置。缺失2个碱基后的扩增产物的核苷酸序列为seq id no.1所示，正常扩增产物的核苷酸序列为seq id no.2所示。
[0045]
(2)将上述扩增产物进行测序，检测indel分子标记位点的基因型，与统计的表型进行对应，统计结果如下表所示：
[0046]
表3.统计表型结果
[0047]
[0048][0049]
统计结果表明：在f2代群体单株中，当表型为红叶矮杆时indel分子标记位点的基因型为a，当表型为绿叶高杆株时indel分子标记位点的基因型为act。
[0050]
上述结果说明本发明筛选的indel分子标记，可作为与陆地棉矮红株红叶矮杆性状紧密连锁的indel分子标记，可以用于红叶矮杆性状的分子标记辅助选择以及棉花矮化品种的选育。
[0051]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。