一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用的制作方法

本发明属于分子标记，具体涉及一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用。

背景技术：

1、大口黑鲈原产于美国加利福尼亚州，中国台湾地区于20世纪70年代引进，广东地区也于1983年引进大口黑鲈苗，并于1985年相继人工繁殖成功。根据最新渔业统计，其养殖产量已达47.8万吨，并达到10％的涨幅，是我国年涨幅第二大鱼类。因其肉质鲜美，抗病能力强，生长迅速等诸多优点，深受大众喜爱，已迅速成为我国的重要养殖品种。研究表明，雌性大口黑鲈在生长速度和体型上都比雄性更快。而大口黑鲈雌雄个体在外部形态差异不明显，无法通过肉眼分辨雌雄，想要通过外部形态或组织学观察判断其遗传性别十分困难。

2、开发性别相关分子标记是培育单性大口黑鲈以期提高其产量的有效手段。扩增性别相关分子标记的引物是快速筛选繁殖两性种群的最有效和可行的前提。因此性别相关分子标记可用于对生物的遗传性别进行准确地识别，在性别控制育种和性别决定分子机制等研究中有着十分重要的作用。目前已有许多鱼类找到了性别相关的dna分子标记，建立了以pcr为基础的遗传性别鉴别技术。而在大口黑鲈的性别鉴定上较为成熟的分子标记技术还鲜有报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，确定snp3(35142120)位点存在a/t多态性，与大口黑鲈的雌雄性别紧密连锁，能够用于准确判断大口黑鲈的性别。

2、本发明提供了一种用于鉴定大口黑鲈的雌雄性别的扩增引物，可快速准确地扩增大口黑鲈的雌雄性别相关的分子标记。

3、本发明提供了一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述seq id no:1所示的序列第56位存在a/t多态性。

4、本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的引物，包括核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物。

5、本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的试剂盒，包括限制性内切酶taai酶切试剂或qpcr检测试剂。

6、优选的，所述限制性内切酶taai酶切试剂包括限制性内切酶taai和酶切缓冲液；

7、所述qpcr检测试剂包括taqman探针和qpcr扩增引物。

8、优选的，所述qpcr扩增引物包括核苷酸序列如seq id no:6所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:7所示的反向引物；

9、所述taqman探针的核苷酸序列如seq id no:8和seq id no:9所示。

10、本发明提供了所述分子标记或所述试剂盒在检测大口黑鲈性别中的应用。

11、本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的方法，包括以下步骤：

12、提取待测大口黑鲈的基因组dna；

13、将所述基因组dna为材料基于所述分子标记的多态性位点进行检测，根据检测结果判断待测大口黑鲈的性别。

14、优选的，所述检测包括限制性内切酶taai酶切检测和/或taqman探针检测。

15、优选的，采用限制性内切酶taai酶切检测的方法为将pcr产物进行taai酶切，将酶切产物进行电泳分析，若得到一条988bp的条带，判断待测大口黑鲈为雌鱼；若得到一条988bp的条带的同时，还包括一条1268bp和1508bp的条带，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

16、优选的，采用taqman探针检测的方法，将qpcr产物根据探针上的荧光颜色判断待测大口黑鲈的snp位点基因型：根据具体基因型判断大口黑鲈的性别：

17、荧光颜色显示tt基因型，判断待测大口黑鲈为雌鱼；

18、荧光颜色显示at和aa基因型，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

19、本发明提供的与大口黑鲈性别相关的分子标记，核苷酸序列如seq id no:1所示，所述seq id no:1所示的序列第56位存在a/t多态性，属于snp分子标记。本发明基于雌雄个体的大口黑鲈重测序数据开发得到snp分子标记。所述snp分子标记与大口黑鲈的性能紧密连锁，能够准确区分大口黑鲈的性能，其中tt基因型为大口黑鲈雌性，at和aa基因型为大口黑鲈雄性。可见，本发明提供的分子标记为大口黑鲈全雌或全雄养殖以获得更高产量，提高经济效益，促进产业的发展提供了可行方法，同时具有快速、准确的检测特点。

技术特征：

1.一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述seq id no:1所示的序列第56位存在a/t多态性。

2.一种检测大口黑鲈性别的引物，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物。

3.一种检测大口黑鲈性别的试剂盒，其特征在于，包括限制性内切酶taai酶切试剂或qpcr检测试剂。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶taai酶切试剂包括限制性内切酶taai和酶切缓冲液；

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述qpcr扩增引物包括核苷酸序列如seqid no:6所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:7所示的反向引物；

6.权利要求1所述分子标记或权利要求3～5任意一项所述试剂盒在检测大口黑鲈性别中的应用。

7.一种检测大口黑鲈性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述检测包括限制性内切酶taai酶切检测和/或taqman探针检测。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，采用限制性内切酶taai酶切检测的方法为将pcr产物进行taai酶切，将酶切产物进行电泳分析，若得到一条988bp的条带，判断待测大口黑鲈为雌鱼；若得到一条988bp的条带的同时，还包括一条1268bp和1508bp的条带，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，采用taqman探针检测的方法，将qpcr产物根据探针上的荧光颜色判断待测大口黑鲈的snp位点基因型：根据具体基因型判断大口黑鲈的性别：

技术总结
本发明提供了一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用，属于分子标记技术领域。本发明提供了一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述SEQIDNO:1所示的序列第56位存在A/T多态性。同时本发明基于所述分子标记再结合限制性内切酶技术和/或Taqman探针技术开发了一套可以快速准确鉴定大口黑鲈性别的方法，仅需剪取少量尾鳍样品，对鱼体无任何伤害。

技术研发人员：强俊,华吉祥,徐钢春,陶易凡,路思琪,孙建国,李岩,徐跑
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13