Derp1融合蛋白及其应用

der p 1融合蛋白及其应用
技术领域
1.本发明涉及蛋白表达技术领域，具体涉及der p 1融合蛋白及其应用。


背景技术：

2.过敏性鼻炎(ar)是所有过敏性疾病中最常见的一种，并与患者的生活质量下降、工作效率降低以及医疗费用增加，临床上这会导致典型的鼻漏、打喷嚏、瘙痒和鼻塞症状。炎症细胞的全身循环允许它们渗透到已经存在化学引诱剂和粘附分子的其他组织中。因此，除了局部炎症外，ar还会引发全身性炎症，进而加剧上呼吸道和下呼吸道的炎症。因此，ar与各种合并症有关：哮喘、鼻窦炎、鼻息肉和浆液性中耳炎以及睡眠障碍。2005年和2011年自我国报告的ar患病率相比，11个城市中有8个城市的ar患病率显着增加(广州、北京、长春、沈阳、上海、南京、杭州和西安)，而户尘螨(hdm)是全球最常见的气体过敏原，不仅在常年ar中，而且在过敏性哮喘中。世界卫生组织/国际免疫学会联合会的名单上公布了20多种hdm过敏原，其中dermatophagoides pteronyssinus 1(der p 1)是hdm提取物的主要成分，被认为是最重要的hdm过敏原。因此，通过der p 1融合蛋白的体外制备是研究常年性变应性鼻炎发病机制是一种重要手段。
3.目前针对变应性鼻炎的研究多使用变应原粗提物，其弊端是成分复杂，用于处理细胞或动物实验，实验可重复性较差，在致病机制的探究中无法阐明具体是那种蛋白或成分发挥的致病作用；而通过液相色谱、质谱等手段分离的天然的der p 1蛋白价格昂贵。所以，目前通过使用微生物表达纯化是获得der p 1蛋白行之有效的方法。目前仅有的针对于der p 1蛋白微生物表达纯化的技术是将获得的重组杆状病毒质粒bacmid-der p 1，通过转染昆虫细胞sf9后，纯化带有his标签的der p 1蛋白，但利用该技术进行der p 1蛋白的表达纯化，操作步骤复杂，试验条件要求高，培养及纯化成本高，且现有的变应原致敏蛋白纯化方法均在构建时并不带有荧光标记，无法更好的进行体内科学研究和示踪。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供der p 1融合蛋白及其应用。
5.本发明提供了一种编码der p 1的核酸，其包括如下i)～iv中的任意一种：
6.i)、序列如seq id no:2所示的核酸；
7.ii)、与如i)所示的核酸具有至少80％同源性且与i)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；
8.ii)、如i)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；
9.iv)、与如i)所示的核酸互补或部分互补的核酸。
10.进一步的，本发明所述的der p 1来源于户尘螨，其未优化的核苷酸序列如seq id no:1所示，优化后的核酸序列如seq id no:2所示。本发明经实验表明，优化序列编码的der p 1蛋白表达量高、溶解性大、蛋白活性强。
11.本发明提供了一种融合蛋白，其自n端至c端依次包括荧光蛋白，linker和本发明
所述的der p 1。所述的der p 1由本发明所述的核酸编码。
12.进一步的，所述的荧光蛋白选自红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白及以上所述荧光蛋白的衍生物，本发明对此不做限定。本发明中，所述的荧光蛋白与der p 1利用linker连接，所述的linker为连接短肽，其包括(ggggs)n，其中n为1～10；本发明实施例中，所述linker序列为(ggggs)3。
13.更进一步的，本发明利用绿色荧光蛋白egfp与der p 1进行组合构建融合蛋白，用于der p 1蛋白表达示踪。结果表明，经序列优化后的荧光蛋白与der p 1的组合蛋白的表达量高，活性强，能够准确对der p 1进行荧光定位及追踪，有利于致敏蛋白对鼻窦炎引发机制的研究。
14.更进一步的，在一些具体实施例中，本发明所述的融合蛋白由n端至c端依次包括der p 1-(ggggs)
3-egfp-his；所述的融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示。
15.本发明还提供了编码所述融合蛋白的核酸。其包括：
16.本发明所述的核酸；
17.和编码绿色荧光蛋白的核酸，如seq id no:4所示。
18.本发明中，所述绿色荧光蛋白是经过密码子优化的，其优化前的序列如seq id no:3所示，其优化后的序列如seq id no:4所示。
19.一些具体实施例中，所述编码融合蛋白的核酸序列如seq id no:6所示。
20.本发明中还提供了所述编码融合蛋白的核酸的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的dna序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(a)信号等。
21.本发明提供了一种重组载体，其包括：
22.载体骨架和本发明所述的核酸；
23.或载体骨架和所述编码融合蛋白的核酸。
24.进一步的，本发明所述的重组载体包括适用于真核、原核、及动物细胞等具有目标蛋白表达必要元件的重组载体，本发明对此不做限定。
25.更进一步的，本发明所述的重组载体为适用于大肠杆菌目的蛋白表达的重组载体。本发明以pet28a为载体对所述的融合蛋白进行表达。
26.更进一步的，本发明所述的重组载体，还包括所述的核酸或编码融合蛋白的核酸以单个或重复串联形式形成的重组载体，本发明对此不做限定。
27.本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组dna分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对原核生物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。
28.本发明提供了一种宿主，其转化或转染如下i)～iii)所示中至少一种：
29.i)、本发明所述的核酸；
30.ii)、本发明所述编码融合蛋白的核酸；
31.iii)、本发明所述的重组载体。
32.进一步的，本发明所述的宿主为原核表达宿主，本发明所述的原核表达宿主为大肠杆菌。
33.更进一步的，在一些具体实施例中，本发明所述的宿主为大肠杆菌bl21(de3)。
34.在本发明中，所述的宿主还包括转化或转染所述的重组载体的其他类型真核细胞形成的宿主，本发明在此不做限定。
35.本发明提供了所述宿主的制备方法，包括将本发明所述的重组载体转化或转染宿主细胞。所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。本发明一些实施例中，所述表达系统的制备方法包括将本发明所述的重组载体通过化学转化的方法转化大肠杆菌bl21(de3)。
36.本发明提供了der p 1蛋白的制备方法，其通过发酵本发明所述的宿主，获得含有der p 1蛋白的产物。
37.进一步的，本发明所述的含有der p 1蛋白的产物，包括der p 1蛋白及其融合蛋白的发酵液、菌体、上清、或含有der p 1蛋白或融合蛋白的活性物质，本发明对此不做限定。
38.进一步的，本发明还提供了含有所述产物的制剂，所述的制剂剂型可以为菌粉、颗粒或菌液，本发明对此不做限定。
39.本发明提供了融合蛋白及本发明所述的制备方法制得的含有der p 1蛋白的产物在制备防治过敏性疾病的药物和/或过敏性疾病的诊断试剂中的应用。
40.本发明中，所述的过敏性疾病包括但不限于呼吸道过敏。所述的呼吸道过敏包括过敏性鼻炎、过敏性哮喘等。
41.进一步的，本发明还提供了防治过敏性鼻炎的药物和/或过敏性鼻炎的诊断试剂，包括本发明所述的融合蛋白，和/或本发明所述的制备方法生产的融合蛋白。
42.更进一步的，本发明所述的诊断试剂还包括用于检测der p 1表达或der p1体内、体外蛋白互作的elisa试剂、western blot试剂、gst-pull down试剂、co-ip试剂、ip试剂，本发明对此不做限定。
43.更进一步的，本发明所述的诊断试剂还包括医学上可接受的辅料或载体与融合蛋白制成的检测纸或检测卡。所述检测纸或检测卡的检测方法可以是肉眼观察、也可以是机读，也可以是肉眼观察和机读的结合，本发明对此不做限定。
44.本发明还提供了过敏性鼻炎的诊断方法，其利用本发明所述的融合蛋白，或本发明所述的制备方法制得的产品，或本发明所述的诊断试剂对过敏性鼻炎进行诊断。
45.本发明得到了以下有益效果：
46.本发明构建了der p 1重组载体，表达产物带有egfp的融合标签，可用于致敏蛋白der p 1鼻窦炎引发机制的研究。试验结果表明经核苷酸序列密码子优化后的der p 1-egfp融合蛋白的表达量高、活性强，能对der p 1表达情况进行定位及示踪；且融合蛋白制备简单、成本低，在过敏性疾病诊断和治疗领域具有广阔的应用前景。
附图说明
47.图1示pet28a-egfp-der p 1重组表达载体；
48.图2示序列优化前蛋白表达情况；
49.图3示序列优化后egfp-der p 1蛋白表达形式摸索，其中，m：marker，1：诱导前，2：诱导后，3：破碎上清，4：破碎沉淀；
50.图4示序列优化后egfp-der p 1蛋白的表达纯化；
51.图5示序列优化后elisa检测der p 1蛋白结合活性；
52.图6示序列优化前荧光实验检测der p 1细胞定位，其中，绿色荧光代表egfp-der p 1，蓝色荧光代表细胞核，放大倍数400
×
，标尺20μm；
53.图7示序列优化后荧光实验检测der p 1细胞定位，其中，绿色荧光代表egfp-der p 1，蓝色荧光代表细胞核，放大倍数400
×
，标尺20μm。
具体实施方式
54.本发明提供了der p 1融合蛋白及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
55.优化前der p 1的核苷酸序列为：1的核苷酸序列为：(如seq id no:1所示)。
56.优化后der p 1的核苷酸序列为：
(如seq id no:2所示)。
57.优化前egfp的核苷酸序列为：优化前egfp的核苷酸序列为：优化前egfp的核苷酸序列为：(如seq id no:3所示)。
58.优化后egfp的核苷酸序列为：
(如seq id no:4所示)。
59.所述的融合蛋白的氨基酸序列为：所述的融合蛋白的氨基酸序列为：所述的融合蛋白的氨基酸序列为：(如seq id no:5所示)。
60.所述的编码本发明所述的所述融合蛋白的重组核酸的核苷酸序列为：
(如seq id no:6所示)。
61.所述的linker序列为：ggggsggggsggggs(如seq id no:7所示)。
62.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
63.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
64.实施例1重组表达载体构建及蛋白表达
65.1、重组载体构建
66.首先我们构建了含有egfp的重组表达载体，如图1所示。选择原核表达载体pet28a(+)，并在酶切位点ndei和xhoi之间插入hdm der p 1的cds区，并在art v 1和der p 1片段后插入绿色荧光蛋白egfp片段，并将两个片段用3
×
ggggs的柔性肽段相连，对序列进行优化改造，使得序列更适宜在大肠杆菌中表达。优化前的der p 1核苷酸序列如seq id no:1所示，优化后的der p 1核苷酸序列如seq id no:2所示；优化前的egfp核苷酸序列如seq id no:3所示，优化后的egfp核苷酸序列如seq id no:4所示。将der p 1与egfp优化前和优化后的序列整合如上所述的位点，构建优化前后序列的重组载体。序列优化前的蛋白表达情况如图2所示，蛋白表达量低或者基本无表达，很难得到der p 1蛋白。优化后的重组表达
载体具有四点优势：1、能够表达变应原致敏蛋白art v 1和der p 1；2、该融合蛋白带有绿色荧光，便于观察其在细胞内的定位；3、表达的蛋白带有6
×
his标签，便于融合蛋白的表达纯化；4、用柔性肽将art v 1或der p 1与egfp相连，避免蛋白表达时的相互干扰及错误折叠，尽可能保证致敏蛋白的活性及绿色荧光蛋白的正常表达。
67.2、融合蛋白表达形式探究
68.egfp-der p 1蛋白的表达形式进行探究，sds-page电泳考马斯亮蓝染色结果如图3所示，在超声破碎上清中仅存在少部分egfp-der p 1，而大部分egfp-der p 1蛋白存在于超声破碎沉淀中，这一结果表明egfp-der p 1主要以包涵体形式表达，并不是以可溶性表达的形式存在。
69.3、融合蛋白表达纯化
70.随后对egfp-der p 1蛋白进行表达纯化，egfp-der p 1蛋白以包涵体形式表达，存在于超声破碎沉淀中，因此无法直接通过超声破碎上清与ni-nta-agarose结合进行纯化。因此我们首先富集超声破碎沉淀，并使用含有8m尿素的变性缓冲液对包涵体蛋白进行变性，洗涤，离心。随后富集离心后的上清，此时的上清再与ni-nta-agarose结合，通过binding buffer、washing buffer的洗涤和elution buffer的洗脱，结果如图4所示，在第7泳道洗脱液中得到纯度较高的egfp-der p 1蛋白。使用含有2m尿素的复性缓冲液对纯化后的蛋白进行复性，此时得到具有蛋白活性的egfp-der p 1蛋白。
71.4、融合蛋白活性检测
72.我们检测了阴性对照蛋白bsa、纯化后的egfp蛋白和egfp-der p 1与抗der p 1抗体的结合活性，实验结果如图5所示，阴性对照蛋白bsa及纯化的egfp蛋白(图中nc组)与抗der p 1几乎没有结合活性，而纯化的egfp-der p 1(图中der p 1组)与抗der p 1抗体有较强的结合活性。
73.5、融合蛋白示踪定位情况
74.为了探究纯化后的致敏蛋白der p 1是否能够进入鼻黏膜上皮细胞中，我们体外培养人鼻黏膜上皮细胞系hnepc中，并将其铺于细胞爬片上，细胞贴壁后使用无血清的dmem饥饿细胞6h。随后将10μg纯化除盐后的egfp-der p 1融合蛋白加入细胞培养上清中，继续培养12h，随后对爬片上的细胞进行固定，使用含有dapi的封片液封片，同时对细胞核进行染色，结果如图5和图6所示，hnepc细胞中，优化前的蛋白荧光较弱，优化后的融合蛋白可以观察到较强的绿色荧光蛋白egfp-der p 1，通过merge的图片我们观察到该绿色荧光分布在细胞核周围及细胞核内。
75.上述实验结果表明，体外表达纯化的egfp-der p 1可以进入到hnepc中并且几乎视野内的全部细胞均可以观察到绿色荧光蛋白，且绿色荧光蛋白偶联的der p 1与细胞核有部分共定位，证明致敏蛋白进入鼻黏膜上皮细胞中不但可以在细胞质中富集还可以进入到细胞核内，在细胞核中富集。
76.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。