分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用的制作方法

分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.血型系统是根据红细胞膜上抗原种类不同而对血液进行分型的体系，猫公认的血型系统是ab血型系统，包括a、b、ab三种血型。现有技术中常使用植物小麦凝集素lectin识别neuac从而凝集猫b型血，用于猫b型血的鉴定。但由于不同厂家供应的lectin品质差别较大，且不能提供稳定的供货保障，不易实现对猫血型鉴定的工业化和标准化，因此，开发特异型识别neuac抗原的单克隆抗体，用于猫b型血型的检测尤其必要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，方便对猫进行血型检测。
4.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：本发明提供一种分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为cctcc no:c2022268。
5.进一步的，所述抗猫b型血型特异性单克隆抗体由如上所述的分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备。
6.进一步的，所述抗猫b型血型特异性单克隆抗体为igm单克隆抗体，所述抗猫b型血型特异性单克隆抗体与猫的b型血红细胞发生凝集。
7.本发明提供一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，其特征在于，包含如上所述的抗猫b型血型特异性单克隆抗体。
8.本发明提供一种血型检测装置，所述装置包含如上所述的血型检测试剂、试纸或试剂盒。
9.本发明提供一种如上所述的抗猫b型血型特异性单克隆抗体，或血型检测试剂、试纸或试剂盒在猫血型检测上的应用。
10.本发明提供一种血型检测方法，其特征在于，所述方法包括将待测样品与如上所述的抗猫b型血型特异性单克隆抗体接触，确定待测样品的血型。
11.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：本发明提供的分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌的抗猫b型血型特异性单克隆抗体为igm单克隆抗体，该抗猫b型血型特异性单克隆抗体与猫的b型血红细胞发生凝集，而与猫的其他血型血红细胞不发生凝集反应，应用在猫血型检测操作简单，且具有反应迅速、测定结果准确度高的优点。
附图说明
12.图1是本发明实施例提供的抗猫b型血型特异性单克隆抗体的凝胶电泳图；图2是本发明实施例提供的抗猫b型血型特异性单克隆抗体凝集结果示意图，其中图a1-a3为抗猫b型血型特异性单克隆抗体与a型红细胞不发生凝集示意图，图b1-b3为抗猫b型血型特异性单克隆抗体与b型红细胞发生凝集示意图；图3是本发明实施例提供的抗猫b型血型特异性单克隆抗体的亚型鉴定结果示意图。
具体实施方式
13.下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
14.分泌抗猫b型血型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为b35g，于2022年8月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏编号为cctcc no：c2022268。
15.分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体为igm单克隆抗体，该抗猫b型血型特异性单克隆抗体与猫的b型血红细胞发生凝集，而与猫的其他血型血红细胞不发生凝集反应，测定结果精度高，应用在猫血型检测。
16.实施例一：杂交瘤细胞的获得1.免疫原及检测抗原的制备(1)本实施例的免疫原选用新鲜的edta抗凝的b型血猫红细胞，先使用生理盐水至少洗涤三次，再用生理盐水配置成3％红细胞悬液。
17.(2)检测抗原选用新鲜的猫a、b型红细胞，生理盐水洗涤三次，用生理盐水配置成3%浓度的红细胞悬液。
18.2.免疫动物(1)用免疫原免疫6周龄，体重约20g的balb/c雌性小鼠，使用0.5ml免疫原直接腹腔注射。
19.(2)两周后加强免疫，0.5ml免疫原直接腹腔注射。
20.(3)加强免疫三天后取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合试验。
21.3.细胞融合(1) 取上述免疫动物小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按5:1-10:1的比例混匀，1000rpm离心5分钟，去除培养基。
22.(2) 使用无血清的rpmi-1640培养基洗涤一次，1000rpm离心5分钟，去除培养基。
23.(3) 使用50％peg（聚乙二醇，购自sigma，分子量1500）作为融合剂进行融合，室温融合2min，使用无血清的rpmi-1640培养基终止融合，1000rpm离心5分钟。
24.(4) 细胞沉淀用含hat的rpmi-1640完全培养基悬浮，分装到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。
25.4.杂交瘤细胞的筛选及克隆
(1)融合的细胞在培养箱中静置培养10-14天，中途半量换液2次，融合细胞生长至约覆盖孔底1/3时进行取培养上清进行筛选。
26.(2)在u型96孔酶标板中加入细胞培养上清50ul，分别与50ul生理盐水配置的3％猫a、b型红细胞混匀，室温反应半小时，1000rpm离心1min，温和震荡，观察并记录凝集试验结果。
27.(3)筛选跟猫b型红细胞凝集而与a型红细胞无凝集的细胞孔作为阳性孔细胞，进行细胞扩大培养和单克隆化，即获得一株能稳定分泌抗猫b型血型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株b35g。扩大培养后，冻存细胞，置于液氮保存。
28.实施例二：抗猫b型血型的单克隆抗体试剂的制备(1) 将获得的杂交瘤细胞株b35g用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基扩大培养。pbs洗涤2次后用pbs重悬，调整杂交瘤细胞悬液密度为5x106/ml。
29.(2)6周龄balb/c小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂（sigma），一周后腹腔注射0.5 ml 杂交瘤细胞悬液，7-10天后取腹水。
30.(3) 将含单克隆抗体的腹水经过12000rpm， 10分钟离心后，取上清，加入10倍体积的去离子水，使抗体析出；再12000rpm，离心15分钟后，抗体沉淀用pbs溶解，测定a280吸光度，计算抗体浓度a280/1.18。用pbs稀释调整抗体浓度为1 mg/ml，分别取5 ug、10ug、20ug 抗体加入1x还原型上样缓冲液，10% sds-page电泳，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示，可见到分子量为70 kda的igm 重链及25 kda的轻链。
31.实施例三：分泌抗猫b型血型的单克隆抗体的特异性鉴定采用试管法对制备的抗猫b型血型的单克隆抗体进行特异性鉴定，具体操作步骤如下：(1)取a，b血型红细胞各3例，用生理盐水洗涤3次，2000rpm离心5分钟，最后用生理盐水配置成3％红细胞悬液。
32.(2)按每组3支试管，共2组，图2中的a1、a2及a3为a型血红细胞，b1、b2及b3为b型血红细胞，各加入20 ug/ml b35g单克隆抗体0.1ml，然后在各试管分别加入3％a，b血型红细胞悬液0.1ml，置室温反应15分钟，经过1000r/min离心1min，温和震荡，观察有无凝集。
33.图2为本实施例提供的抗猫b型血型特异性单克隆抗体凝集结果示意图，其中图a1-a3为抗猫b型血型特异性单克隆抗体与a型红细胞不发生凝集示意图，图b1-b3为抗猫b型血型特异性单克隆抗体与b型红细胞发生凝集示意图。从图中可知3支b型血红细胞全部发生凝集，而3支a型血红细胞没有发生凝集，具有显著的特异性。
34.实施例四：抗体亚型鉴定按照proteintech的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作规程要求操作，将50ul b35g杂交瘤细胞培养上清加入elisa板条中，加入50ul hrp标记的各亚型抗体二抗，室温孵育1小时，pbst洗3遍后tmb显色。
35.图3为本实施例提供的抗猫b型血型特异性单克隆抗体的亚型鉴定结果示意图，结果显示b35g单克隆抗体为igm, 轻链为kappa型。
36.本发明提供一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，包含抗猫b型血型特异性单克隆抗体；一种血型检测装置，包含血型检测试剂、试纸或试剂盒，均能够应用在猫的血型检测。
37.本发明还提供一种血型检测方法，该方法步骤中包括将待测样品与抗猫b型血型特异性单克隆抗体接触，用于确定待测样品的血型。
38.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。