一种基于高度共轭COFs的光响应模拟氧化酶及其制备方法与应用

一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于尿酸检测技术领域，具体涉及到一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.尿酸(ua)是嘌呤类生物碱的最终代谢产物，同时也是关节炎、子痫前期、肾脏疾病、心血管疾病等疾病的重要生物标志物，因此实现血清中尿酸的高效便捷检测对上述疾病的诊断至关重要。目前，用于尿酸检测的方法有液相色谱法、电化学法、酶解法、化学发光法、毛细管电泳法等。以上方法大多是基于尿酸酶的水解作用或尿酸的氧化还原特性来制备相应的传感器。不可否认，以上方法用于血清中尿酸的实际检测中会存在一些不可忽视的缺点，如：
3.1.检测仪器昂贵，样品前处理复杂；
4.2.尿酸酶价格昂贵，稳定性差，难以有效保存；
5.3.血清成分复杂，干扰因素多样，检测准确度难以保证。
6.因此，开发高效便捷的尿酸检测手段成为研究热点。比色法是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法，具有仪器精简、操作简单等优点。截止目前，已有不少基于比色法检测尿酸的方法已被开发出，但这些方法大都是通过杂合具有氧化能力的金属或通过纳米氧化酶催化外加过氧化氢氧化有色底物来还原尿酸，使体系褪色。基于纳米氧化酶的内在特性，大多数金属纳米酶都难以回收利用，且含昂贵属或重金属，这不仅增加了制备成本，也对后处理工艺和环境保护提出了更高的挑战。
7.相比之下，光催化技术以其环保、高效、可持续的优势，在解决能源和环境挑战方面具有广阔的前景。但光催化的性能高度依赖于光敏材料的设计，合理的设计可以实现高效的光收集、促进电荷分离和传输、加速表面反应。因此，如何设计高效利用光源且绿色环保的光敏材料用于尿酸的有效检测成为重中之重。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶及其制备方法与应用，可以绿色高效、快速便捷、简单精准地检测血清中尿酸含量。
9.为达上述目的，本发明提供了一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将1,3,5-三[4-氨基(1,1-联苯-4-基)](tabb)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛(bdb)共溶于混合溶液中，于超声条件下加入乙酸溶液，对反应物进行冷冻抽气后加热反应；
[0011]
(2)将加热后得到的产物固液分离，洗涤至上清液无色后，将固体真空干燥后于混合溶液中进行热反应；
[0012]
(3)将步骤(2)反应后得到的产物清洗后制得固体产物，将固体产物经索氏提取和真空干燥后，制得。
[0013]
进一步地，1,3,5-三[4-氨基(1,1-联苯-4-基)](tabb)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛(bdb)质量比为90-95:30-35，混合溶液由体积比1:1的1,4-二氧六环和1,3,5-三甲苯混合制得，1,3,5-三[4-氨基(1,1-联苯-4-基)]苯溶解后的浓度为25-30mg/ml。
[0014]
进一步地，乙酸溶液的浓度为17-18mol/l，乙酸溶液与混合溶液的体积比为0.2:3。
[0015]
进一步地，步骤(1)加热的温度为110-130℃，加热的时间为70-75h；冷冻抽气的温度为-20℃，冷冻抽气的时间为5-10min。
[0016]
进一步地，步骤(2)中真空干燥的温度为45-55℃，真空干燥的时间为10-15h。
[0017]
进一步地，步骤(2)中的溶液由体积比为1:1的正丁醇和邻二甲苯混合得到，溶液中还包括体积分数为8-10％的乙酸(此处意思是乙酸体积分数占整个混合后溶液的8-10％)，热反应温度为110-130℃，热反应的时间为70-75h。
[0018]
进一步地，索氏提取的溶剂为无水四氢呋喃，索氏提取的温度为110-130℃，索氏提取的时间为45-50h，步骤(3)真空干燥的温度为45-55℃，真空干燥的时间为10-15h。
[0019]
本发明还公开了采用上述基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶的制备方法制备得到了基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶。
[0020]
本发明还公开了上述基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶在制备尿酸检测试剂中的应用。
[0021]
尿酸检测试剂包括基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶和有色底物，有色底物为2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。
[0022]
综上，本发明具有以下优点：
[0023]
1、本发明通过选择含多苯环单体(tabb)设计具高度共轭结构的共价有机框架(cofs)实现了光的有效收集和利用，在催化有色底物生成具氧化性的oxabts与尿酸反应后，通过监测体系的颜色变化实现尿酸的有效检测。
[0024]
2、本发明制得的高度共轭的cofs，具规则大孔道(孔径为4nm)，结构清晰，比表面积大，利于底物(abts)的扩散；且由轻元素组成，不包含任何金属离子，对环境友好。
[0025]
3、本发明制得的高度共轭的cofs，具有优异的化学稳定性和水稳定性，使其在多次循环使用化后仍拥有良好的光催化活性(5次循环后，光催化能力未见明显损失)。
[0026]
4、本发明制得的高度共轭的cofs，具光响应模拟氧化酶性质，对abts的亲和力远大于辣根过氧化物酶，同时也具较高的最大反应速率(v
max
)，这有利于在光反应过程中快速将有色底物氧化，缩短反应时间。
[0027]
5、本发明制得的基于高度共轭cofs的光响应模拟样氧化酶用于检测尿酸浓度时，检测范围较宽(5-160mg/l)，可满足一般情况下人血清中尿酸检测需求。
附图说明
[0028]
图1为tabb-bdb cof和tapb-bdb cof合成示意图；
[0029]
图2为tabb-bdb cof和tapb-bdb cof的电化学性能测试结果；
[0030]
图3为tabb-bdb cof光响应模拟氧化酶活性探究结果；
[0031]
图4和图5为尿酸浓度-δa标准曲线；
[0032]
图6为当存在ua和可能的干扰物质时，混合溶液在730nm处的相对吸光度；
[0033]
图7为tabb-bdb cof光催化循环稳定性测试结果。
具体实施方式
[0034]
本发明提供了一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
(1)将质量比为90-95:30-35的1,3,5-三[4-氨基(1,1-联苯-4-基)]苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛共溶于体积比为1:1的1,4-二氧六环和1,3,5-三甲苯中，于超声条件下加入浓度为17-18mol/l的乙酸，对反应物进行冷冻抽气后加热至110-130℃反应70-75h；冷冻抽气的温度为-20℃，冷冻抽气的时间为5-10min；
[0036]
(2)将加热后得到的产物固液分离，洗涤至上清液无色后，将固体于45-55℃条件下真空干燥10-15h，再置于体积比为1:1的正丁醇和邻二甲苯混合得到的溶液中进行热反应；溶液中还包括体积分数为8-10％的乙酸，热反应温度为110-130℃，热反应的时间为70-75h；
[0037]
(3)将步骤(2)反应后得到的产物清洗后制得固体产物，将固体产物于110-130℃条件下经索氏提取45-50h后，再置于45-55℃条件下真空干燥10-15h，制得棕黑色粉末(tabb-bdb cof)。
[0038]
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0039]
实施例1
[0040]
本实施例提供了一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶，其经过以下步骤制得：
[0041]
(1)称取92mg的1,3,5-三[4-氨基(1,1-联苯-4-基)]苯(tabb，0.16mmol)和32mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛(bdb，0.24mmol)置于pyrex(一种耐热玻璃管)管中，加入各1.5ml的1,4-二氧六环和1,3,5-三甲苯(1:1，v/v)，将以上混合物超声分散3min。
[0042]
(2)在超声氛围下，向混合物中加入0.2ml乙酸溶液(17.45mol/l)，使其混合均匀。随后，将混合物进行冷冻抽气，避免加热时管内压力过大引起危险。将管子置于120℃中加热72h。冷冻抽气的温度为-20℃，冷冻抽气的时间为5min。
[0043]
(3)加热72h后将所得到棕褐色固体与体系分离，以甲醇洗涤，直至上清变为无色。随后将固体在50℃下真空干燥12h，得到棕褐色粉末。将得到的固体粉末在含9％乙酸的正丁醇和邻二氯苯(1:1，v/v)溶液中120℃溶剂热72h，以甲醇和四氢呋喃各洗涤3次，得到棕黑色固体粉末。
[0044]
(4)将固体粉末置于无水四氢呋喃中，在120℃下索氏提取48h。随后在50℃下真空干燥12h，得到棕黑色粉末(tabb-bdb cof)(合成示意图如图1左)。
[0045]
实施例2
[0046]
本实施例提供了一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶，其经过以下步骤制得：
[0047]
(1)称取95mg的1,3,5-三[4-氨基(1,1-联苯-4-基)]苯和32mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛(bdb，0.24mmol)置于pyrex(一种耐热玻璃管)管中，加入各1.5ml的1,4-二氧六环和1,3,5-三甲苯(1:1，v/v)，将以上混合物超声分散3min。
[0048]
(2)在超声氛围下，向混合物中加入0.2ml乙酸溶液(17mol/l)，使其混合均匀。随后，将混合物进行冷冻抽气，避免加热时管内压力过大引起危险。将管子置于120℃中加热72h。冷冻抽气的温度为-20℃，冷冻抽气的时间为5min。
[0049]
(3)加热72h后将所得到棕褐色固体与体系分离，以甲醇洗涤，直至上清变为无色。随后将固体在50℃下真空干燥12h，得到棕褐色粉末。将得到的固体粉末在含9％乙酸的正丁醇和邻二氯苯(1:1，v/v)溶液中120℃溶剂热72h，以甲醇和四氢呋喃各洗涤3次，得到棕黑色固体粉末。
[0050]
(4)将固体粉末置于无水四氢呋喃中，在120℃下索氏提取48h。随后在50℃下真空干燥12h，得到棕黑色粉末(tabb-bdb cof)。
[0051]
实施例3
[0052]
本实施例提供了一种基于高度共轭cofs的光响应模拟氧化酶，其经过以下步骤制得：
[0053]
(1)称取90mg的1,3,5-三[4-氨基(1,1-联苯-4-基)]苯(tabb，0.16mmol)和35mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛置于pyrex(一种耐热玻璃管)管中，加入各1.5ml的1,4-二氧六环和1,3,5-三甲苯(1:1，v/v)，将以上混合物超声分散3min。
[0054]
(2)在超声氛围下，向混合物中加入0.2ml乙酸溶液(18mol/l)，使其混合均匀。随后，将混合物进行冷冻抽气，避免加热时管内压力过大引起危险。将管子置于120℃中加热72h。冷冻抽气的温度为-20℃，冷冻抽气的时间为5min。
[0055]
(3)加热72h后将所得到棕褐色固体与体系分离，以甲醇洗涤，直至上清变为无色。随后将固体在50℃下真空干燥12h，得到棕褐色粉末。将得到的固体粉末在含9％乙酸的正丁醇和邻二氯苯(1:1，v/v)溶液中120℃溶剂热72h，以甲醇和四氢呋喃各洗涤3次，得到棕黑色固体粉末。
[0056]
(4)将固体粉末置于无水四氢呋喃中，在120℃下索氏提取48h。随后在50℃下真空干燥12h，得到棕黑色粉末(tabb-bdb cof)。
[0057]
对比例1
[0058]
为了探究tabb-bdb cof优异光催化活性的来源，以苯环较少、共轭度小的tapb替代tabb，合成了苯环数量不同，但拓扑结构和取代基相同的tapb-bdb cof，合成方法如下：
[0059]
(1)称取56mg的三(4-氨基苯基)苯(tapb，0.16mmol)和32mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛置于50ml锥形瓶中。向瓶中加入40ml乙腈，超声混匀。
[0060]
(2)在超声氛围下，向其中逐滴加入1ml乙酸(17.45mol/l)使其混合均匀。乙酸滴加完后将混合液继续置于超声氛围中30min。超声完毕后将其静置24h。
[0061]
(3)将所得到的橙红色固体以甲醇和四氢呋喃洗涤，离心分离。直至上清液无色。将固体粉末置于无水四氢呋喃中，在120℃下索氏提取48h。随后在50℃下真空干燥12h，得到橙红色粉末(tapb-bdb cof)(合成示意图如图1右)。
[0062]
试验例1
‑‑‑
光催化性质探究
[0063]
通过电化学工作站对两种cofs进行瞬态光电流响应、电化学阻抗测试及光致发光
光谱测试，其结果如图2所示，其中图2(a)为tabb-bdb cof和tapb-bdb cof瞬态光电流测试，图2(b)为tabb-bdb cof和tapb-bdb cof电化学阻抗测试，图2(c)为tabb-bdb cof和tapb-bdb cof光致发光光谱测试。
[0064]
如图2(a)和图2(b)所示，多苯环的tabb-bdb cof具更高的光电流密度和更小的界面转移电阻。此外，光致发光(pl)发射光谱测试，即图2(c)所示，说明tabb-bdb cof具更低的电子-空穴复合率。以上结果说明本发明提供的制备方法合成的高共轭tabb-bdb cof具更强的光生电子转移速率和更低的电子-空穴复合率。
[0065]
试验例2
‑‑‑
tabb-bdb cof光响应模拟氧化酶活性探究
[0066]
以2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)为有色底物，由于其氧化产物oxabts在418nm和730nm具特征吸收，因此通过监测体系730nm处吸光度来探究其模拟氧化酶性能。
[0067]
具体方法如下：
[0068]
称取3mg实施例1制备的tabb-bdb cof，置于不同abts浓度溶液中(v＝3ml)，460nm的蓝光作为激发光源，在28w、室温下进行光催化反应。5min后将abts反应液过滤出，得到不同浓度的oxabts溶液。取200μl置于96孔板中，用酶标仪检测其730nm下吸光度。通过双倒数作图法计算其米氏常数(km)和最大反应速率(v
max
)，如图3所示。图3(a)为tabb-bdb cof的稳态动力学分析，图3(b)为双倒数作图法计算tabb-bdb cof的米氏常数(km)和最大反应速率(v
max
)。
[0069]
由图3可以看出，本发明实施例1所合成的tabb-bdb cof其km为6.54
×
10-5
mol/l，v
max
为3.75
×
10-7
m/s。
[0070]
同时本实施例提出的tabb-bdb cof光响应模拟氧化酶活性探究，可以说明高共轭的tabb-bdb cof具光响应模拟氧化酶性质，对abts的亲和力远大于辣根过氧化物酶，同时也具较高的v
max
，这有利于在光反应过程中快速将底物(abts)氧化，缩短反应时间，如表1所示。
[0071]
表1模拟酶动力学参数对比
[0072]
催化剂底物km(mm)v
max
(m/s)moo
3 npsabts1.68-uio-66-nh2@ceabts0.722.04
×
10-7
hrpabts0.53-cys
–
mos2abts0.151.61
×
10-7
mip+-h/血红素abts0.562.43
×
10-7
mno/pc纳米复合物abts0.18.94
×
10-7
fe3o4@au
–
cys
–
faabts0.441.10
×
10-7
tabb-bdb cofabts6.54
×
10-2
3.75
×
10-7
[0073]
试验例3
‑‑‑
尿酸检测
[0074]
尿酸作为嘌呤代谢的最终产物，由于其显著的抗氧化活性，对生物体内维持正常的生理活动具有巨大意义。基于tabb-bdb cof优异的光响应模拟氧化酶特性，在可见光的激发下可催化有色底物(abts)生成蓝绿色的oxabts，基于oxabts的氧化活性可与尿酸反应导致体系褪色，通过检测体系颜色变化实现尿酸检测。
[0075]
具体步骤如下：
[0076]
(1)oxabts溶液制备：称3mg实施例1制得的tabb-bdb cof置于光反应玻璃管，加入3ml以ph＝5的磷酸缓冲液配制的浓度为1mmol/l的abts溶液，在460nm、28w、室温下进行光催化反应。光反应15min后，可观察到体系颜色由无色变为蓝绿色，将溶液过滤除去tabb-bdb cof固体，得到蓝绿色oxabts溶液。
[0077]
(2)尿酸检测范围及检测限：称取5mg尿酸，溶于1ml浓度为1mol/l的naoh溶液中，再将其转移至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度线，得到200mg/l的尿酸原液。
[0078]
将原液按照不同配比进行稀释，得到不同浓度的尿酸溶液(分别为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160mg/l)。取400μl步骤(1)制得的oxabts反应液，加入20μl不同浓度的尿酸溶液，混匀，作实验组。空白组以蒸馏水替代尿酸溶液。取混匀后的溶液200μl置于96孔板中，在730nm下测定吸光度。
[0079]
通过空白组和实验组的吸光度差(δa)，建立尿酸浓度-δa标准曲线，如图4和图5所示。其中图4为tabb-bdb cof光催化生成的oxabts与不同浓度尿酸在730nm处的吸光度变化曲线，图5为尿酸检测标准曲线。
[0080]
图5中，y＝0.00618x+0.0359，r2＝0.9943；
[0081]
根据检测限(lod)公式：lod＝3s/k，算得lod＝3.57mg/l；
[0082]
其中，s为大于20次空白组吸光度标准差，k为所得的标准曲线斜率。
[0083]
将本试验例对尿酸浓度的检测范围与常规测试方法检测尿酸浓度的检测范围进行整理(如表2所示)，可以看出，本试验例所得的尿酸检测范围较宽(5-160mg/l)，可满足一般情况下人血清中尿酸检测需求。
[0084]
表2尿酸检测范围与其他对比
[0085][0086][0087]
试验例4
‑‑‑
干扰试验
[0088]
血清组分复杂，其中的一些氨基酸或金属离子可能会对尿酸检测产生干扰。本试验例对当存在ua和可能的干扰物质(100mg/l)时，混合溶液在730nm处的相对吸光度进行测试，如图6所示。
[0089]
由图6可知，本发明制备的高共轭tabb-bdb cof光响应模拟氧化酶在用于尿酸比
色检测时，对人体中常见的一些氨基酸(赖氨酸、天冬氨酸、苏氨酸)、金属离子(na
+
、k
+
、mg
2+
、hco
32-)及还原性物质(谷胱甘肽、半胱氨酸、抗坏血酸)不具干扰。
[0090]
试验例5
‑‑‑
基于高共轭tabb-bdb cof的光响应模拟氧化酶活性循环测试
[0091]
将实施例1制备的基于高共轭tabb-bdb cof的光响应模拟氧化酶用于光催化循环，测试其光催化活性循环稳定性。
[0092]
其过程为：称3mg实施例1制得的tabb-bdb cof置于光反应玻璃管，加入3ml以ph＝5的磷酸缓冲液配制的浓度为1mmol/l的abts溶液，在460nm、28w、室温下进行光催化反应。光反应15min后，将溶液过滤除收集得tabb-bdb cof固体，再重复上述操作4次。
[0093]
其结果如图7所示，基于高共轭tabb-bdb cof的光响应模拟氧化酶优异的化学稳定性和水稳定性，使其在多次循环使用化后仍拥有良好的光催化活性(5次循环后，光催化能力未见明显损失)。
[0094]
试验例6
‑‑‑
血清实际样本检测
[0095]
将实施例1制备的基于高共轭tabb-bdb cof的光响应模拟氧化酶用于实际血清中尿酸检测。具体操作步骤如试验例3所示。
[0096]
对所得的三份血清进行定量分析，检测结果与临床数据如表3所示，本发明制备的高共轭tabb-bdb cof光响应模拟氧化酶用于血清中尿酸比色检测结果与临床数据吻合，相对标准偏差(rsd)小于4％；此外，为了进一步检验此法的准确性，进行了血清中外加尿酸的回收率研究，如表4，结果显示尿酸检测的回收率在99.68～99.77％，相对标准偏差(rsd)小于4％。以上结果表明，本法提出的基于高度共轭tabb-bdb cof的光响应模拟氧化酶适用于复杂生物环境中尿酸的定量检测。
[0097]
表3血清样本中尿酸检测(n＝3)
[0098][0099]
表4血清中外加尿酸回收测试(n＝3)
[0100]
[0101]
虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。