一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用的制作方法

1.本发明涉及核酸恒温扩增技术领域，特别涉及一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用。


背景技术：

2.常规的单重和多重pcr技术由于热循环的特殊条件要求，需要依赖于昂贵的pcr仪器，限制了这一技术在实验室之外的广泛应用。恒温核酸扩增技术正好解决的上述问题的限制，是一个不可逆转的趋势。在过去的十年当中，一些恒温核酸扩增技术，例如tma技术(转录介导的核酸扩增技术)、sda技术(链置换核酸扩增技术)、lamp(环介导核酸扩增技术)、had(解旋酶依赖等温核酸扩增技术)等，得到快速发展，都可以用于dna在等温条件下扩增。这些技术只需要一个相对较低温且恒定的反应温度(60-65℃)就可以实现高效的核酸扩增，使整个反应摆脱对精密温度循环控制的pcr仪的依赖。然而这一技术仍然需要温度控制装置来保持60-65℃的反应温度，这同样限制了恒温核酸扩增技术的广泛应用。
3.重组酶介导核酸恒温扩增技术(recombinase
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aid amplification，raa)技术是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。raa法利用重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶代替了传统pcr的热循环解链过程，实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环pcr反应。现有技术中，中国专利申请cn110387405a提供了一种快速检测核酸的(rt)raa-crispr系统，该系统包括常温恒温扩增系统和crispr检测系统，常温恒温扩增系统又包括核酸扩增系统和rna转录系统；核酸扩增系统包括逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、dna聚合酶、辅助蛋白、恒温常温扩增系统化学试剂和raa引物组；重组酶来源于大肠杆菌的reca或t4噬菌体重组酶uvsx；单链结合蛋白源于e.coli或t4的gp32蛋白；辅助蛋白的序列可选自t4噬菌体的uvsy蛋白；dna聚合酶的序列可源于e.coli的dna聚合酶iklenow大片段、bst聚合酶、phi-29聚合酶或枯草芽孢杆菌po1i(bsu)；重组酶恒温扩增系统化学试剂包括tris、rnase抑制剂、dntps、rntp、磷酸肌酸二钠盐、乙酸钾、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、二硫苏糖醇、pcr引物、引导rna和taqman探针，还公开了。然而，这种恒温常温扩增系统化学试剂灵敏度有限，检测下限为10^4copies以上，对于某些低浓度病毒样本，无法像常规热循环pcr方法那样进行接近单分子级别的高灵敏度检测。
4.纳米等离子体共振(nanospr)检测技术，是在纳米等离子体共振生物芯片上制作出直径不超过500nm的纳米孔阵列，通过入射光与金属纳米孔结构的共振耦合，利用表面等离子体共振的波长对于纳米结构周围介电环境的敏感性，实现对生化反应的检测。当吸附分子的折射率与周围环境的折射率存在差异时，吸附于基底表面的生物分子与目标分子的反应会改变基底表面的折射率，从而引起共振峰的变化，实现目标待测物质的检测。因此，纳米表面等离子体传感器的共振分析过程无需使用传统spr技术那样的复杂光学系统。将nanospr技术应用于raa技术中具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用，利用了bsu dna聚合酶在另外几个带有复制蛋白的重组酶蛋白存在的条件下，能将新生成的核酸单链从新合成的dna双链上置换下来的机理，在常温(37-42℃)下实现对特定核酸序列进行高效指数级扩增，10min实现104倍的扩增。这使得核酸扩增的过程对仪器的要求降到最低，不需要进行传统的热循环。与传统的raa反应不同的是，本发明提供的反应试剂中，高浓度的高分子量的聚乙二醇和甘油作为拥挤剂，刺激关键蛋白与dna的相互作用，大大提高荧光值。试剂以冻干粉的形式运输保存，促进了它们在疾病快速诊断，炎症因子和肿瘤标志物筛查等技术中的应用。具体通过以下技术实现。
6.一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，包括的原料和相应的浓度分别为50-200mm tris缓冲液、50-200mm乙酸钾、5-30mm乙酸镁、5-30mm二硫苏糖醇、5-20wt％聚乙二醇、1-15mm atp、0.2-3mm dntps、20-100mm磷酸肌酸、20-200μg/l肌酸激酶、10-200mg/l海藻糖、1-10wt％甜菜碱、500-1500mg/l t4gp32蛋白、50-300mg/l t4uvsx重组酶、10-100mg/l t4uvsy辅助蛋白、1-5u核酸外切酶、5-100mg/l bsu dna聚合酶，还包括正向引物、反向引物和荧光探针，且每种引物或荧光探针的浓度为150-600nm；所述正向引物、反向引物为未经修饰的正向引物和未经修饰的反向引物，或为氨基化正向引物和氨基化反向引物，或为巯基化正向引物和巯基化反向引物。
7.本发明提供的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中，raa由2个关键蛋白(t4uvsx重组酶和单链dna结合蛋白gp32)组成。复制是由具有链置换活性所需的bsu dna聚合酶完成的。
8.聚乙二醇作为拥挤剂刺激raa关键蛋白与dna的相互作用。
9.t4 uvsx重组酶是具有配对和链转移活性的重组酶，在反应体系中与引物结合形成引物-蛋白复合体，携带引物对dna模板进行扫描识别与结合，当引物识别到同源序列后即可发生链置换反应，以替代pcr反应中热变性步骤。
10.t4 uvsy蛋白是重组酶的辅助蛋白，增强t4 uvsx的单链dna依赖atpase活性并降低活性所需的t4 uvsx临界浓度。
11.t4 gp32蛋白是一种单链结合蛋白，参与dna复制、修复、重组，与解链后的ssdna结合，防止自杂交。
12.bsu dna聚合酶的作用是，使引物与模板结合发生链置换反应，对模板上的扩增目标区域进行指数扩增。
13.dntps包括datp、dttp、dctp、dgtp，是dna聚合酶用来合成新模板的构件。
14.peg和甘油作为拥挤试剂可以增强酶的活性，刺激raa关键蛋白与dna的相互作用，很好的模拟了体内真实的生物大分子条件并促进了扩增。
15.dtt是一种消除游离巯基的稳定酶；
16.atp、磷酸肌酸和肌酸激酶这三种成分构成了重组酶和dna聚合酶活动的能量供应系统；
17.tris和醋酸钾：提供缓冲环境，用于稳定反应体系；
18.乙酸镁是酶性能的辅助因子，作为raa反应的激活剂，镁离子的加入使得raa反应开始进行。
19.甜菜碱可帮助dna聚合酶顺利通过dna某些复杂二级结构，防止dna聚合酶的从模板dna中解离。dna局部区域因含有多个复杂碱基(py-g-c)，会促使dna聚合酶的停滞，最终导致dna聚合酶停止有效延伸。而甜菜碱可提高dna小沟中富含鸟嘌呤和胞嘧啶区域的鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响dna分子结构，改变dna灵活性，帮助dna聚合酶沿着dna模板延伸；大大改善扩增效率和扩增特异性、改善逆转录效率等。
20.海藻糖是一种双糖，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效的保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖可中和抑制剂对dna聚合酶的抑制作用，维持pcr扩增效率,可作为酶保护剂，用于dna聚合酶、逆转录酶等工具酶的稳定剂，大大改善扩增效率和扩增特异性、改善逆转录效率等。
21.本发明提供的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统的作用原理是：t4uvsx重组酶在t4uvsy辅助蛋白的辅助下，与单链寡核苷酸引物和探针结合，扫描双链dna(dsdna)寻找同源序列，当引物识别到dsdna后，引物与模板进行结合，t4uvsx重组酶自动脱离，在后续扩增中进行重复使用。在反应中，t4uvsx重组酶打开dsdna模板，t4gp32蛋白结合dna模板的另一条链，并防止开放的dna模板相互杂交。在bsu dna聚合酶的作用下合成一个新的dna链与dna模板互补。反应在37-42℃范围内的某一恒定温度下执行，在5-20min内完成。具体的扩增温度和时间取决于起始模板的拷贝数和扩增子的大小。此外，可以通过将逆转录酶加入本发明常温核酸扩增链替换反应试剂成分中来扩增rna靶标，单一温度下反应(rt反应温度为40-42℃))，仍然能够在20min内检测靶标。
22.t4gp32蛋白、t4uvsx重组酶、bsu dna聚合酶这三个主要的酶可以使dna实现指数扩增，而不需要热循环或初始的化学或热熔步骤。
23.与现有的常规raa反应不同的是，本发明在海藻糖和甜菜碱的促进作用下，大大提高扩增效率，增大荧光值，使得raa反应更加适用于与核酸快检设备联合使用。目前尚未发现将海藻糖和甜菜碱协同使用，作为重组酶介导核酸恒温扩增反应体系。
24.优选地，包括的原料和相应的浓度分别为50mm tris缓冲液、100mm乙酸钾、15mm乙酸镁、5mm二硫苏糖醇、8wt％聚乙二醇、3mm atp、0.5mm dntps、50mm磷酸肌酸、80μg/l肌酸激酶、150mg/l海藻糖、2wt％甜菜碱、500mg/l t4gp32蛋白、350mg/l t4uvsx重组酶、55mg/l t4uvsy辅助蛋白、90mg/l bsu dna聚合酶、5u核酸外切酶；还包括引物组合，且所述正向引物的浓度为400nm，所述反向引物的浓度为400nm，荧光探针的浓度为120nm。
25.优选地，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
26.优选地，所述荧光探针是在如seq id no.3所示的序列上设计四个修饰位点，分别为：在距离5’端的32bp的中部位置标记1个dspacer，在dspacer的上游距离该识别位点1个碱基的位置标记1个荧光基团，在dspacer的下游距离该识别位点1个碱基的位置标记1个淬灭基团，再在3’端末端标记1个封闭基团。
27.本发明还提供了一种恒温核酸扩增的方法，利用上述任意一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统。
28.优选地，上述恒温核酸扩增的方法，是先将nanospr生物芯片进行mpa的化学处理，使芯片表面先羧基化，然后再将羧基进一步活化，再将氨基化修饰引物加入微孔中进行孵
育。此时，芯片表面的羧基基团会和扩增引物上的氨基基团发生脱水缩合反应，使引物偶联到芯片板上，而后将扩增反应体系加入到芯片表面，进行恒温扩增反应，具体包括以下步骤：
29.s1、取nanospr生物芯片进行表面羧基化处理，再用nhs/edc活化表面的羧基；对所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中的正向引物和/或反向引物进行氨基化修饰；
30.s2、再将氨基化修饰引物共价偶联在nanospr生物芯片上；
31.s3、将所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中剩余的试剂加至装载有共价偶联了氨基化修饰引物的nanospr生物芯片的微孔中，进行恒温扩增反应。
32.更优选地，步骤s1中，所述nanospr生物芯片的表面羧基化处理和活化表面羧基的具体步骤为：
33.s11、首先在装有nanospr生物芯片的微孔中加入50μl 50mm tcep溶液，反应20min；
34.s12、然后在每个微孔中加入50μl 50mm mpa溶液，4℃过夜，完成nanospr生物芯片表面的羧基化处理；
35.s13、用50mm ph＝4.5的mes溶液将nhs/edc稀释至50mm，在每个微孔中分别加入50μl反应20min，活化nanospr生物芯片的表面的羧基。
36.优选地，上述的恒温核酸扩增的方法，是用tcep溶液将正向引物和/或反向引物进行化学处理，去除二硫键(防止引物发生自交链，后续影响扩增效果)，再将巯基化引物与nanospr生物芯片进行孵育，使引物上的巯基与金属发生金硫键反应，使引物固定在芯片表面；最后将扩增反应体系加入到nanospr生物芯片上，进行恒温扩增反应，具体包括以下步骤：
37.p1、对所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中的引物合成巯基化正向引物和/或巯基化反向引物，并通过化学方法去除二硫键；
38.p2、然后将处理后的扩增引物与nanospr生物芯片进行孵育；
39.p3、将所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中剩余的试剂加至装载有共价偶联了氨基化的引物的nanospr生物芯片的微孔中，进行恒温扩增反应。
40.更优选地，步骤p1中，去除正向引物和/或反向引物的二硫键的方法为：取1μmol巯基化的正向引物和/或反向引物，加入4μl 20-200mm tcep溶液反应1-2h。
41.本发明还提供了一种用于恒温核酸扩增的检测试剂盒，包括上述任意一种的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统。
42.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
43.(1)本发明提供的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，检测试剂简单，检测步骤少，操作简单，检测速度快，仅需5-20min；检测灵敏度高，检测限低至单拷贝数每反应；
44.(2)除了应用于科研以外，还可以应用于分子诊断。可在实验室之外进行实验，对仪器及操作人员的要求降低，使本反应体系和检测方法可应用于传染性呼吸道疾病的核酸快速检测，炎症因子以及肿瘤标志物等检查项目的快速筛查，应用前景广泛，使核酸家庭自检成为可能；
45.(3)该反应试剂与nanospr生物芯片结合，将正向引物或反向引物其中一条固定在nanospr生物芯片表面，而后在芯片表面进行恒温扩增反应，可提高灵敏度10-50倍。
3mm、dntps 500um、磷酸肌酸50mm、肌酸激酶80ng/ul、海藻糖150mg/ml、甜菜碱2％、t4gp32蛋白500ng/μl、t4uvsx重组酶350ng/μl、t4uvsy辅助蛋白55ng/μl、bsu dna聚合酶90ng/μl、核酸外切酶5u、引物hpv16-f 400nm、引物hpv16-r 1400nm、引物hpv16-p 120nm、模板hpv16质粒5ul。
67.3、扩增仪器和反应条件
68.扩增仪器：多功能荧光酶标仪；厂家：perkinelmer，型号：victor nivo；反应时间：20min-30min；反应温度：39℃；反应微孔板：96孔pcr板。
69.4、检测结果
70.如图1所示。
71.实施例2：将实施例1的与nanospr生物芯片联用的检测方法的效果验证
72.本实施例所使用的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统与实施例1基本相同，区别在于，合成氨基化hpv16-f引物，将nanospr生物芯片表面进行了羧基化活化处理。
73.1、nanospr生物芯片表面羧基化处理，以及羧基的活化处理
74.(1)取装载有nanospr生物芯片的微孔板，在每个微孔中加入50mm的tcep溶液，每个孔位加入50μl，反应20min，去除芯片表面的二硫键；
75.(2)然后nanospr生物芯片芯片板里加入50mm的mpa溶液，每个孔位加入50μl，4℃过夜，对芯片表面进行羧基化处理；
76.(3)后用50mm的mes溶液(ph4.5)将nhs和edc分别稀释至50mm，每个孔位分别加入50μl，对芯片表面的羧基进行活化处理20min。
77.上述方法所用的试剂tcep(三(2-羧乙基)膦)、mpa(3-巯基丙酸)、nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)采购于麦克林公司，mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)采购于bioforxx公司，edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)采购于sigma公司。
78.2、正向引物hpv16-f氨基化
79.氨基化修饰的正向引物hpv16-f委托上海生工生物工程有限公司合成。
80.氨基化hpv16-f的序列为：
[0081]-nh
2-ctgtcaaaagccactgtgtcctgaagaaaag
[0082]
3、将氨基化正向引物偶联到nanospr生物芯片表面
[0083]
本实施例将氨基化正向引物hpv16-f偶联到表面羧基化活化的nanospr生物芯片表面，具体方法为：用100mm的mes(ph＝4.5)溶液将氨基化正向引物hpv16-f稀释至1nmol，每个微孔加入50μl稀释引物溶液，37℃偶联2h，再使用mch(6-巯基-1-己醇)对nanospr生物芯片进行封闭，封闭结束后的nanospr生物芯片水洗两遍，去除残留的封闭液。试剂mes采购于bioforxx公司，mch采购于sigma公司。
[0084]
4、扩增检测
[0085]
将重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中的其他反应试剂(包括反向引物hpv16-r)加入到微孔板的微孔中，立即将微孔板放入到实时荧光酶标仪(perkinelmer)进行读值检测。检测结果如图2所示。
[0086]
实施例3：将实施例1的与nanospr生物芯片联用的检测方法的效果验证
[0087]
本实施例所使用的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统与实施例1基本相同，区别在于，合成巯基化正向引物hpv16-f。
[0088]
1、正向引物hpv16-f巯基化
[0089]
(1)巯基化修饰的正向引物hpv16-f委托上海生工生物工程有限公司合成。巯基化hpv16-f的序列为：
[0090]-sh-ctgtcaaaagccactgtgtcctgaagaaaag；
[0091]
(2)取1μmol巯基化正向引物hpv16-f溶液，用4μl 50mm tcep混合均匀，37℃反应2小时，去除二硫键；以防止引物后期发生自交链，后续影响扩增效果；
[0092]
2、巯基化正向引物hpv16-f与nanospr生物芯片反应
[0093]
将上述混合液50μl/孔加至每个微孔中，4℃过夜孵育，使引物上的巯基与金属发生金硫键反应使引物固定在芯片表面；再使用mch对芯片进行封闭，封闭nanospr芯片表面未结合位点。封闭结束后的芯片版进行水洗两遍，去除残留的封闭液
[0094]
3、扩增检测
[0095]
将重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中的其他反应试剂(包括反向引物hpv16-r)加入到微孔板的微孔中，立即将微孔板放入到实时荧光酶标仪(perkinelmer)进行读值检测。检测结果如图3所示。
[0096]
对比例1：不含乙酸钾、海藻糖和甜菜碱的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统和检测过程
[0097]
与实施例1不同的是，本对比例的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统的配方为：tris缓冲液50mm、乙酸镁15mm、二硫苏糖醇5mm、聚乙二醇5％、atp 3mm、dntps 500um、磷酸肌酸50mm、肌酸激酶80ng/ul、t4gp32蛋白500ng/μl、t4uvsx重组酶350ng/μl、t4uvsy辅助蛋白55ng/μl、bsu dna聚合酶90ng/μl、正向引物hpv16-f 400nm、反向引物hpv16-r 400nm、荧光探针hpv16-p 120nm、稀释后的模板hpv16质粒5ul。所使用的样本、扩增引物、荧光探针，以及其他仪器和检测方法与实施例1相同。检测结果如图4所示。
[0098]
通过对比实施例1-3和对比例1的附图1-4可以发现，实施例1的检测结果显示检出时间比对比例1提前了2-5min，扩增到达平台期的时间提前了10min，说明调整效果很好。采用氨基化或巯基化的正向引物，与nanospr生物芯片联用，能够使样本的荧光值提高了10倍，采用本发明技术方案nanospr芯片等温扩增核酸检测满足15分钟内检测＜10copies/ml低浓度病毒样本的要求。
[0099]
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。