一对控制西瓜侧枝长短的基因ClSLB/Clslb及其用途

一对控制西瓜侧枝长短的基因clslb/clslb及其用途
技术领域
1.本发明涉及一对控制西瓜侧枝长短的基因clslb/clslb及其用途。本发明属于生物技术领域。


背景技术：

2.西瓜(citrullus lanatus l.)是一种重要的葫芦科作物，世界十大果品中名列第五，在园艺作物生产和消费中占据十分重要的地位。我国是世界上最大的西瓜生产和消费国，据联合国粮农组织(fao)统计，2020年我国西瓜种植面积1405.87 千公顷，种植总产量达到了6024.69万吨。
3.实现西瓜简约化栽培，对节约生产成本、促进产业发展极为重要。现有西瓜品种多为长侧枝品种，在整个生长周期各节间均会生长出侧枝，目前我国设施内栽培西瓜多采用单蔓或双蔓整枝的栽培模式，因此在种植过程中需要投入大量的人工劳动力来除去多余的侧枝，不仅极大的增加了生产成本，同时过多的侧枝也会降低植株的种植密度，影响采光和通风，而且过多的营养生长会制约生殖生长，最终影响西瓜的品质和产量。因此，短侧枝品种的培育可大大降低劳力的支出，对西瓜简约化、机械化等农业实践具有重要意义。但短侧枝种质资源缺乏，却制约了西瓜短侧枝品种的选育。因此，选育短侧枝西瓜新品种，对实现西瓜简约化和机械化等栽培新模式，促进西瓜规模化和产业化发展具有重要意义。
4.发明人的前期研究结果表明，西瓜侧枝长短性状是由一对等位基因 clslb/clslb调控的。我们以长侧枝西瓜品系gwas-38和短侧枝西瓜突变体slb 为亲本，构建f2代分离群体，通过田间表型鉴定，明确了西瓜短侧枝性状的遗传规律。利用全基因组重测技术结合bsa法对调控西瓜短侧枝性状的候选基因进行初步定位，进而利用分子标记技术及重组单株的筛选，对候选基因进行精细定位，最终发现控制西瓜短侧枝性状的基因为cla97c05g088180.1，将其命名为clslb。以上研究结果可为进一步研究西瓜侧枝形成的分子机制及短侧枝品种的选育提供理论依据。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一对控制西瓜侧枝长短的基因clslb/clslb，为研究西瓜侧枝形成的分子机制、侧枝长短的分子鉴定、短侧枝种质资源的筛选、分子标记辅助育种以及加快短侧枝品种的选育效率提供理论基础。
6.本发明的另一目的在于提供一种可鉴定或辅助鉴定西瓜短侧枝西瓜品种的方法。
7.为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
8.首先，本发明提出了一种控制西瓜短侧枝性状的基因clslb，其核苷酸序列如 seq id no.1所示。
9.所述基因clslb编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.进一步的，本发明还提出了一种控制西瓜长侧枝性状的基因clslb，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.所述基因clslb编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
12.更进一步的，本发明还提出了一种在分子水平上鉴定西瓜材料是否具有短侧枝性状的方法，所述的方法包括通过检测待测材料基因中是否存在所述的控制西瓜短侧枝性状的基因clslb，同时不存在所述的控制西瓜长侧枝性状的基因clslb，来鉴定该品种是否为短侧枝西瓜品种；其中，长侧枝基因clslb和短侧枝基因 clslb为等位基因，clslb为显性基因，clslb为隐性基因。
13.其中，优选的，所述的检测为直接通过全基因组重测序的方法进行，或是通过测序clslb或clslb基因的pcr产物后，进行产物大小比对进行鉴定。
14.其中，优选的，所述的检测在种子或者苗期进行鉴定。
15.本发明中的，长侧枝基因clslb和短侧枝基因clslb为等位基因。其中，clslb 为显性基因，即含有该基因的西瓜植株表型为长侧枝(基因型表现为clslb/clslb 或clslb/clslb)；clslb为隐性基因，即仅含有该基因的西瓜植株表型为短侧枝(基因型表现为clslb/clslb)。
16.更进一步的，本发明还保护包含上述基因的试剂盒，具体应用时，可以选择该基因外显子上的突变点，合成引物做成试剂盒，应用于西瓜短侧枝理想株型的筛选。可以在苗期准确快速的鉴定出目的植株是否具有短侧枝性状，加快理想株型的选育。
17.更进一步的，本发明还保护包含上述基因的载体，对于含有插入本发明中基因的表达盒、转基因细胞系，重组菌、重组病毒、重组载体、表达载体及含有该表达载体的宿主细胞、克隆载体，以及上述的构建方法也纳入本发明的保护范围之内。
18.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
19.本发明以长侧枝西瓜品系gwas-38和短侧枝西瓜品系slb为亲本，构建f2代分离群体，通过田间表型鉴定，明确了西瓜短侧枝性状的遗传规律。以全基因组重测技术结合bsa法，并且利用分子标记技术及重组单株的筛选，对调控西瓜短侧枝性状的候选基因进行精细定位。研究结果可为进一步研究西瓜侧枝形成的分子机制及短侧枝基因在株型发育中的作用机制提供理论依据。
20.本发明提供了调控西瓜短侧枝性状的基因clslb。该基因的挖掘，能够在种子或者苗期准确快速地鉴定出西瓜品种是否具有短侧枝性状。为今后本领域技术人员对西瓜短侧枝种质资源的筛选与鉴定、分子标记辅助选择适合简约化和机械化的理想短侧枝西瓜栽培品种提供扎实的理论技术。
附图说明
21.图1是长侧枝西瓜品系gwas-38和短侧枝西瓜突变体slb表型对比；
22.注：a：gwas-38；b：gwas-38局部图；c：slb局部图；d：slb；比例尺＝2cm；
23.图2是西瓜短侧枝基因clslb的精细定位流程图；
24.注：a：利用f2群体进行基因初步定位；b，c：通过扩大f2群体进行精细定位，将clslb基因定位在indel2和b1-4之间25.354kb范围内；d：候选区段内预测到的基因；e：候选基因结构及通过一代测序对突变位点的确认，黑色方块：外显子，黑色直线：内含子；f：clslb基因碱基的缺失导致突变体蛋白提前终止；
25.图3是西瓜短侧枝基因clslb在西瓜不同组织内的表达量分析；
个体的表型数据，利用joinmap4.0软件进行连锁分析，最终获得西瓜短侧枝性状的初定位区间。如图2a所示，将clslb定位在了 indel2和b1-5之间(标记命名为发明人自行编制，无特殊含义)。
43.4、候选基因的精细定位
44.在初步定位的基础上，本发明进一步将f2群体扩大至1020株。前期根据条带清晰度及碱基缺失或插入数量，选择了两个距离相对较远且条带较清晰的标记 bindel-17和bindel-21，用于重组单株初步筛选的标记，最终获得5个重组单株。然后在初定位的区段内，继续开发分子标记，将具有多态性的分子标记在5个重组单株间依次进行基因分型，最终将clslb定位在了西瓜5号染色体上indel2和 b1-4之间，两个标记间的物理距离约为25.354kb，如图2b、2c所示。
45.为了进一步验证上述的候选基因，进行了如下进一步的实验。
46.实施例2西瓜调控短侧枝性状的基因筛选与鉴定
47.1、候选基因筛选与鉴定
48.以西瓜“97103v2”注释数据库为参考，该25.354kb的区段内，包含两个候选基因，分别为cla97c05g088180.1和cla97c05g088190.1(如图2d)。
49.为了进一步明确调控短侧枝的基因，对候选区段内两个基因及其上游2000bp 的启动子序列进行比较，其中cla97c05g088180.1基因在外显子上存在一个碱基的缺失，内含子存在四个snp突变位点，上游2000bp启动子序列存在四个snp 突变位点。为了检验cla97c05g088180.1基因外显子上的碱基缺失是否真实存在，共设计10对引物，对双亲slb及gwas-38中cla97c05g088180.1基因dna全长进行克隆并测序，基因全长分别为5252bp和5253bp(序列见seq id no.1 和seq id no.3)，双亲序列进行比对发现在slb的cla97c05g088180.1基因的 6,291,086bp处有一个碱基a的缺失，进一步验证cla97c05g088180.1基因为短侧枝性状候选基因。cla97c05g088180.1基因全长5253bp，共有4个外显子和3 个内含子，外显子长度分别为2074bp、808bp、294bp、220bp，编码氨基酸的长度为1131aa，突变体材料因为碱基a的缺失，导致翻译提前终止，编码氨基酸长度截短为854aa(图2e、2f)。
50.通过葫芦科网站序列比对发现cla97c05g088180.1基因与甜瓜光敏色素b的同源性高达98.5％，并且根据前人研究发现，光敏色素b对植物的分枝(分蘖) 有调控作用，因此，我们初步推测cla97c05g088180.1为调控西瓜短侧枝性状的候选基因。
51.2、候选基因表达分析
52.通过qrt-pcr对cla97c05g088180.1基因在长侧枝品系gwas-38和短侧枝突变体slb两叶一心时期的根、下胚轴、子叶、真叶、叶腋和茎尖中的表达量进行分析，结果如图3中所示，真叶，子叶和下胚轴中基因表达量相对较高，根，叶腋和茎尖中表达量很低。cla97c05g088180.1基因在长侧枝品系gwas-38真叶中表达量最高，极显著高于其在突变体slb真叶中的表达量，而基因在gwas-38 子叶和下胚轴的表达量却均极显著低于突变体slb中的表达量。根据 cla97c05g088180.1基因的基因功能可知，该基因的功能是光敏色素，而真叶是植物感受光的部位，长侧枝品系中的cla97c05g088180.1基因可以正常发挥作用，因此表达量高；而短侧枝突变体中的cla97c05g088180.1基因因为碱基缺失导致氨基酸序列变短，基因功能改变，因此表达量低于长侧枝品系。此外，短侧枝突变体slb子叶和下胚轴中
cla97c05g088180.1基因的表达量高于gwas-38，结果有待进一步研究。所以本发明进一步判定cla97c05g088180.1是控制西瓜侧枝长短的候选基因。
53.实施例3利用上述获得的候选基因鉴定西瓜是否为短侧枝品种
54.在上述实施例的基础上，发明人以所收集的来自世界各地的西瓜种质资源为材料，从中选取已完成重测序的144分西瓜材料构建自然群体。(需要强调的是，发明中所用到自然群体中的西瓜品种，表型均为长侧枝材料。材料由发明人在工作过程中收集而来)。
55.利用igv软件将144份西瓜种质资源的重测序序列与双亲材料的重测序序列进行碱基序列比对，验证突变点在自然群体中与短侧枝性状的关联程度。比对结果发现在6,291,086处有一个碱基a的缺失在突变体材料中是特有的，在144份长侧枝材料中无变化，由此推测短侧枝性状的出现，可能是与碱基a的缺失有关。图4为突变体slb与144份种质资源比对的部分结果图。基于以上结果，可以通过测序手段，比对该基因的结构中是否存在本发明中短侧枝基因的突变点，以此鉴定该品种是否具有短侧枝性状。
56.以上所述之实施例，是本发明的最佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明的实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。